miRNA-99b負調控mTOR抑制腦膠質瘤細胞的侵襲能力

馬鵬舉，汲乾坤，李祥生，常海剛，周文科，金保哲

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，河南 新鄉(xiāng)　453100)

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發(fā)性的惡性腫瘤，呈侵襲性生長、復發(fā)率高的特點，其預后較差。腦膠質瘤的本質上是一種多基因異常疾病，其分子機制可能是由于抑癌基因的突變缺失及原癌基因的過表達，導致膠質瘤細胞逃避了正常的調控機制，故膠質瘤相關的異常基因及其作用機制仍為當前的研究熱點[1]。

miRNA是20～25個核苷酸大小的非編碼蛋白的小分子RNA，miRNA 可互補結合靶mRNA 3′非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)端，導致靶mRNA的降解或翻譯抑制，其在轉錄后的水平對靶基因表達形成負調控[2]，影響細胞增殖和凋亡等生物學行為[3-4]。miRNA-99b屬于miRNA-99基因簇，該基因簇的多個成員被證實與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5-7]。哺乳動物雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其表達異常與腫瘤細胞的遷移、侵襲以及腫瘤的復發(fā)和耐藥相關[8]。最新研究表明[9]，miRNA-99b在腦膠質瘤中表達降低，可能與腦膠質瘤發(fā)生、發(fā)展有關，但其在腦膠質瘤中具體靶點尚不明確。本實驗通過前期預實驗及文獻支持，推測miRNA-99b對腦膠質瘤的作用可能是通過靶向調控mTOR。故本研究旨在探討miRNA-99b對腦膠質瘤U251細胞侵襲的影響及調控mTOR作用機制，以期為膠質瘤的治療尋找新的分子靶點。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1臨床標本收集新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自2010年1月至2015年12月手術切除，術后病理證實為腦膠質瘤的標本共36例，其中23例男性，13例女性，年齡18～60歲，平均45.9歲。根據WHO 2007對神經系統腫瘤分類標準進行分級，其中13例低級別腦膠質瘤：包括9例WHOI～II級低級別星形細胞瘤和WHO II級4例少突膠質細胞瘤；23例高級別膠質瘤：包括11例WHO III級間變性星形細胞瘤和12例WHO IV級膠質母細胞瘤。正常對照組：8例正常腦組織(顱腦外傷手術切除)。

1.1.2細胞與試劑腦膠質瘤U251細胞為本實驗室保存。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；逆轉錄、real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miRNA-99b引物、miRNA-99b模擬物(5′-CACCCGUAGAACCGACCUUGCG-3′)、Lipofectamine 2000轉染試劑，購自上海吉凱生物科技公司；mTOR引物、質粒及其內參β-actin由武漢博士德公司合成；mTOR及內參一抗購自美國CST公司；含鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室購自美國Corning公司；mTOR野生型及突變型PsiCHECK熒光報告載體購自廣州銳博生物科技公司。

1.1.3儀器CO2細胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、轉膜儀、生物安全柜(美國Thermo公司)，熒光定量PCR儀器(美國Life公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，精密電子天平(德國Sartorious公司)。

1.1　方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉染用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)腦膠質瘤U251細胞，選取對數期生長的活力較好的細胞種板，按Lipo2000說明書進行轉染。miRNA-99b mimics轉染實驗分3組：空白對照組(Blank)、陰性對照組(mimics control)和miRNA-99b mimics組；mTOR 質粒轉染實驗分為3組：空白對照組(Blank)、陰性對照組(negative control)和mTOR PsiCHECK組。

1.2.2real-time PCR檢測腦膠質瘤組織及細胞中相關mRNA的表達TRIzol法提取組織、細胞的總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，擴增體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL ，cDNA模板 1μL，上、下游引物各0.5 μL，加無核酶水補充至20 μL，于95℃ 30s，95℃ 5s、60℃ 30s，進行35次循環(huán)。采用2-⊿⊿Ct法計算miRNA-99b、mTOR mRNA的表達水平。靶基因miRNA-99b的引物：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游5′-TCACCCGTAGAACCGACCTT-3′，及其內參U6的引物：上游5′-CGCAAGGATGACACG-3′，下游5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′。靶基因mTOR的引物：上游5′-GCGAACCTCAGGGCAAGAT-3′，下游5′-TGACTCATCTCTCGGAGTTCCA-3′，其內參β-actin的引物：上游5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ ，下游5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′。

1.2.3Transwell實驗檢測轉染后U251細胞侵襲能力的變化預熱鋪有Matrigel膠的Transwell小室至37℃，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。上室中加入含1×105個U251細胞的單細胞懸液，培養(yǎng)24 h后棄上室液體，用棉簽擦去上室面未穿過膜的細胞，固定風干后用0.1 %的結晶紫染色20 min。 400倍下計數5個視野中黏附細胞數的平均值，每組設4個復孔。

1.2.4熒光素酶報告基因檢測系統檢測miRNA-99b對mTOR的調控取對數生長期的U251細胞，按5×104個細胞/孔接種于6孔板中。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞融合度為70%左右時，按轉染試劑說明書分別將miRNA-99b mimics和wt mTOR 3′-UTR、mimics control和wt mTOR 3′-UTR、miRNA-99b mimics和mut mTOR 3′-UTR、mimics control和mut mTOR 3′-UTR共轉染至U251細胞。轉染48 h后，按試劑盒說明書提供的方法檢測上述細胞的相對熒光強度值。

1.2.5Western blot法檢測轉染后U251細胞中mTOR蛋白的表達水平將蛋白提取緩沖液加入轉染后的U251腦膠質瘤細胞中，反應后測定裂解液的蛋白濃度，根據濃度進行每孔上樣，于10% SDS-PAGE的膠中進行電泳，轉膜，將膜放置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉，加入mTOR一抗、二抗依次孵育，暗室進行顯影、定影。

1.2.6預后隨訪全部膠質瘤術后患者，隨訪時間：12～53個月。隨訪后記錄患者總生存期(overall survival，OS)，觀察腦膠質瘤患者miRNA-99b表達水平與OS的關系。

2　結果

2.1腦膠質瘤組織中miRNA-99b及mTOR的相對表達水平Real-time PCR檢測高、低級別腦膠質瘤及正常腦組織中miRNA-99b和mTOR的表達水平。如Fig 1所示，miRNA-99b mRNA隨膠質瘤惡性程度的增高而表達明顯減少(F=836.3，P<0.05)；而高級別腦膠質瘤中mTOR mRNA表達水平較對照組明顯增高，隨膠質瘤惡性程度的增高而表達增高(F=136.4，P<0.05)。

2.2轉染miRNA-99b模擬物后U251細胞miRNA-99b的表達水平Fig 2的real-time PCR檢測結果顯示，與Blank組和mimics control組比較，miRNA-99b mimics組細胞miRNA-99b的表達水平明顯升高，差異有統計學意義(F=19.85，P<0.01)。

2.3轉染miRNA-99b模擬物后對U251細胞侵襲能力的影響Fig 3的Transwell實驗結果顯示，與對照組比較，miRNA-99b mimics組的穿膜細胞數明顯減少，差異有統計學意義(F=52.75，P<0.01)。

Fig 1　Expressions of miRNA-99b (A) and mTOR mRNA(B)in glioma tissues and normal brain tissues

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vslow grade

Fig 2　Expression levels of miRNA-99b in U251 cells after transfection with miRNA-99b mimics

**P<0.01vsblank group

2.4miRNA-99b靶基因預測與熒光素酶實驗結果分別將miRNA-99b mimics和wt-mTOR 3′-UTR、mimics control和wt- mTOR 3′-UTR、miRNA-99b mimics和mut-mTOR 3′-UTR、mimics control和mut- mTOR 3′-UTR共轉染至U251細胞后，應用熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行檢測。Fig 4結果顯示，miRNA-99b mimics和wt-mTOR 3′-UTR共轉染組的熒光強度值明顯低于mimics control和wt-mTOR 3′-UTR共轉染組(P<0.05)，而miRNA-99b mimics和mut-mTOR 3′-UTR共轉染組與mimics control和mut-mTOR 3′-UTR共轉染組熒光強度值之間比較無統計學意義。這一結果說明，miRNA-99b可調控mTOR的表達。

Fig 3　Effects of transfection after miRNA-99b mimics on invasion of U251 cells(×400)

A: U251 cells without any transfection; B: U251 cells were transfected with mimics control; C: U251 cells were transfected with miRNA-99b mimics; D: miRNA-99b mimics inhibited U251 cells invasion.**P<0.01vsblank group

Fig 4　U251 cells co-transfected with miRNA-99b mimics and wild-type(A) or mutant(B) mTOR 3′-UTR, and GFP intensity measured by the EGFP reporter assay

*P<0.05vsmimics control+wt- mTOR 3′-UTR group

2.5轉染miRNA-99bmimics后U251細胞mTOR的表達水平Fig 5A的real-time PCR檢測結果顯示，與Blank組和mimics control組比較，miRNA-99b mimics組細胞中mTOR mRNA的表達水平明顯降低，差異有統計學意義(F=11.95，P<0.01)。Fig 5B的Western blot結果顯示，轉染miRNA-99b mimics組mTOR 蛋白表達水平較mimics control組和Blank組明顯降低(F=5.44，P<0.01)，Blank組與miRNA control組相比差異無統計學意義。

Fig 5　The expression levels of mTOR mRNA(A)and protein(B) in U251 cells after transfection with miRNA-99b mimics

**P<0.01vsblank group

2.6轉染mTOR質粒后U251細胞miRNA-99b的表達水平Fig 6的real-time PCR結果顯示，轉染mTOR表達質粒后，mTOR mRNA表達明顯升高，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)；但miRNA-99b表達水平不受mTOR變化的影響，兩組差異無統計學意義。

Fig 6　The expression levels of mTOR mRNA and miRNA-99bevaluated by real-time PCR in U251 cells after transfected with PsiCHECK/mTOR

*P<0.05vsmimics control group

2.7轉染mTOR質粒對U251細胞侵襲能力的影響如Fig 7所示，腦膠質瘤U251細胞轉染miRNA-99b mi+ PsiCHECK/mTOR后，與對照組比較，其腦膠質瘤U251細胞的侵襲能力明顯升高(P<0.01)，表明恢復mTOR表達后，mTOR能明顯恢復因miRNA-99b抑制的細胞侵襲能力。

2.8miRNA-99b的表達水平對膠質瘤患者預后的影響Fig 8 Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達miRNA-99b的膠質瘤患者的平均總生存期為18.5月，而高表達組miRNA-99b的膠質瘤患者平均總生存期為35.0月，miRNA-99b的單變量分析顯示, miRNA-99低表達患者的總生存期明顯低于高表達組，兩組差異有統計學意義(P<0.01)。

3　討論

腦膠質瘤惡性程度高，手術聯合術后的放化療后膠質瘤的預后仍較差，而目前找尋基因水平的治療靶點是腦膠質瘤研究的主要方向。miRNA具有廣泛的基因調節(jié)功能，許多研究發(fā)現，miRNA在腦膠質瘤中表達異常，認為腦膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與miRNA關系密切[3,10]。

miR-99家族是miRNA 家族中進化最原始的一組miRNA，它們調控的靶基因多參與細胞的增殖、分化、轉移和凋亡[11]。研究發(fā)現，miRNA-99b在多種腫瘤中表達水平下調[9]，提示其在腫瘤中可能起到抑癌基因的作用，調控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現[6]，在乳腺癌細胞中，miRNA-99b通過下調轉化生長因子β的表達，導致乳腺癌上皮間質轉化，并可以明顯抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。上調miRNA-99b表達可影響DNA的修復，從而增加腫瘤細胞對放療的敏感性[12]。以上研究表明，miRNA-99b對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預后可能起到非常重要的作用。miRNA-99b在腦膠質瘤中表達較正常腦組織低[9]，但miRNA-99b對腦膠質瘤的影響及相關下游機制尚不清楚，需要進一步驗證。

Fig 7　Cell invasion ability in U251 cells after transfected with PsiCHECK /mTOR showed by Transwell assay

A: U251 cells were transfected with miRNA-99b and PsiCHECK /mTOR; B: U251 cells were transfected with miRNA-99b and PsiCHECK control; C: mTOR mimics restore U251 cells invasion.**P<0.01vsPsiCHECK/mTOR group

Fig 8　Comparison of OS between miRNA-99b high expression group and low expression group in human gliomas

本研究首先發(fā)現腦膠質瘤組織中miRNA-99b的表達水平較其癌旁正常組織明顯降低，得出miRNA-99b在腦膠質瘤組織中呈低表達，并且通過進一步實驗將miRNA-99b mimics轉染入腦膠質瘤U251細胞中，經real-time PCR實驗證實U251細胞中的miRNA-99b表達水平明顯升高，表明轉染成功。Transwell侵襲實驗結果顯示，miRNA-99b的表達水平上調后， U251細胞的細胞侵襲能力明顯受抑制。Kaplan-Meier 生存分析顯示，miRNA-99b高表達的膠質瘤患者的平均總生存期明顯高于低表達miRNA-99b患者。綜上表明miRNA-99b對腦膠質瘤的發(fā)展有重要的作用。

為了進一步探討miRNA-99b對腦膠質瘤細胞的作用及其機制，首先生物信息學預測發(fā)現， mTOR在腦膠質瘤中可能作為miRNA-99b的靶基因，我們進一步通過熒光素酶實驗驗證。結果表明，轉染miRNA-99b模擬物后，mTOR-MUT報告載體的熒光強度基本不受影響，而mTOR-WT報告載體的熒光強度受到明顯影響，表明mTOR mRNA的3′UTR上存在miRNA-99b的結合位點，說明mTOR是miRNA-99b下游靶基因。

mTOR是1個保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，其信號轉導通路失去正常功能可誘發(fā)各種疾病及腫瘤的產生，目前研究表明，mTOR 信號通路在腫瘤細胞的惡性生物學表型中起重要作用。其發(fā)揮作用可能的主要方式包括：在細胞的生長增殖凋亡等過程中發(fā)揮著重要功能，參與細胞內的某些重要的信號轉導過程等[13]。研究發(fā)現mTOR與肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后密切相關[14]，而mTOR在腦膠質瘤作用的具體調控機制尚不清楚。本研究檢測在腦膠質瘤組織中行real-time PCR實驗，在腦膠質瘤組織中mTOR的表達水平較其正常腦組織明顯升高，進一步上調miRNA-99b的表達水平發(fā)現，腦膠質瘤U251細胞中mTOR的mRNA及蛋白表達水平明顯下降。我們研究發(fā)現上調mTOR的表達，不影響miRNA-99b的表達水平，表明miRNA-99b對mTOR的調控作用是單向的，而上調mTOR的表達后，被miRNA-99b抑制的膠質瘤細胞的侵襲能力明顯恢復。綜上表明，上調miRNA-99b可能是通過抑制mTOR，進而抑制腦膠質瘤細胞的侵襲能力。

綜上所述，在腦膠質瘤組織中miRNA-99b呈低表達，miRNA-99b過表達明顯抑制腦膠質瘤U251細胞侵襲，并可能是通過介導mTOR實現的。因此，在腦膠質瘤中miRNA-99b可能作為一種抑癌基因，并可能為腦膠質瘤的基因治療提供了新的思路靶點。

(致謝：本實驗主要在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院河南省神經病學研究所完成，感謝實驗室全體工作人員對本實驗的大力協助。)

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