康復(fù)新液緩解三硝基苯磺酸致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎及其機制研究

張漢超，王朋川，劉　衡,3，耿福能，馬秀英，何　苗,3，張成桂,3，李　玥,3

(1. 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室；2. 藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心；3. 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理　671000；4. 四川好醫(yī)生藥業(yè)集團，四川 成都　610000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)屬炎癥性腸病之一，臨床表現(xiàn)為腹痛腹瀉、里急后重、黏液膿血便等，其發(fā)病機制尚未明了[1]。目前，臨床上治療UC主要以水楊酸制劑和糖皮質(zhì)激素為主，代表藥物有美沙拉嗪和柳氮磺胺吡啶等，但是毒副作用較大，無法長期用于治療。研究表明，免疫失衡在UC發(fā)病過程中起重要作用，過度活化的效應(yīng)細胞產(chǎn)生的抗體、細胞因子、炎癥介質(zhì)等引起組織破壞和炎性病變[2]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6- trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)是一種半抗原物質(zhì)，能與動物腸道黏膜組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合形成完全抗原，導(dǎo)致腸道免疫反應(yīng)及炎癥的發(fā)生。近年來研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊(Periplanetaamericana)在調(diào)節(jié)機體免疫力、修復(fù)腸道黏膜損傷、抗炎鎮(zhèn)痛[3]等方面有明顯的作用，且以美洲大蠊研制的康復(fù)新液，在臨床上采用保留灌腸治療UC已取得了明顯的療效，也有研究探索了康復(fù)新液治療Th2型UC的可能機制[4]。本實驗用TNBS誘導(dǎo)SD大鼠UC模型，考察康復(fù)新液的療效及作用機制，為康復(fù)新液用于UC臨床治療提供實驗依據(jù)。

1　材料

1.1實驗動物健康SPF級♂ SD大鼠(200±10)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗單位使用許可證編號：SYXK(滇)-2011-0004，許可證號：SCXK(湘)-2011-003。

1.2藥物與試劑TNBS，Sigma公司，批號：SLBP0889V；康復(fù)新液，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：160519；柳氮磺吡啶(SASP)腸溶片，上海信宜天平藥業(yè)有限公司，批號：H31020557；大鼠白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)ELISA試劑盒，欣博盛生物科技有限公司，批號：R150929-002a；隱血試劑盒、大鼠白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)試劑盒、轉(zhuǎn)化生長因子-1(transforming growth factor-1，TGF-β1)試劑盒，南京建成生物工程研究所；生理鹽水(NS)，貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司；水合氯醛，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、甲醛溶液，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.3儀器2010酶標(biāo)儀，奧地利安圖斯公司；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；AL204-IC型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；HWS24恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HC-3018R高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；先行者CP214電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司。

1.4受試藥的配制將康復(fù)新液用冷凍干燥機干燥成黏稠狀浸膏，用生理鹽水配制成濃度分別為167、83.5、41.75 g·L-1的高、中、低劑量溶液，按大鼠體重15 mL·kg-1給藥。

2　方法

2.1動物模型的制備取60只♂ SD大鼠，根據(jù)Morris等[5]描述的方法，復(fù)制TNBS誘導(dǎo)的UC模型。大鼠禁食不禁水24 h，用10 g·L-1水合氯醛溶液按3.0 mL·kg-1麻醉大鼠，用直徑2 mm的聚乙烯管于直腸內(nèi)約8 cm處，按75 mg·kg-1灌入TNBS-乙醇溶液(乙醇終體積分?jǐn)?shù)為0.3)，注入后，大鼠倒置使溶液保留10 s，待清醒后正常喂養(yǎng)。另取10只大鼠作為正常組(normal)，采取與模型復(fù)制相同操作，但灌腸用生理鹽水。

2.2動物分組、給藥及DAI評分造模后d 7(以造模當(dāng)日為d 0計)，參考Hamamoto等[6]標(biāo)準(zhǔn)，將大鼠進行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分(以0～3分為極輕度炎癥、4～6分輕度炎癥、7～9分為中度炎癥、10～12分為重度炎癥)，按炎癥嚴(yán)重程度分層隨機分為模型組(model，NS)，SASP組(0.3 g·kg-1)和康復(fù)新液高、中、低劑量組(KFX 2.50、1.25、0.62 g·kg-1)。分組次日(d 8)開始給藥，除正常組和模型組給予生理鹽水灌腸，其余各藥物組給予相應(yīng)的藥物灌腸，每天1次，連續(xù)給藥14 d，于造模后d 1、4、7、10、14、21進行DAI評分。

2.3血清IL-4、IL-17含量的檢測末次給藥后次日(d 22)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，4℃靜置凝固后，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，用試劑盒檢測IL-4、IL-17含量。

2.4臟器指數(shù)、結(jié)腸長寬及CMDI的測定解剖取胸腺、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等臟器，稱量質(zhì)量，計算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=各臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。沿腸系膜緣剪開腸腔，生理鹽水沖洗糞便，觀察腸壁，稱量濕質(zhì)量。采集結(jié)腸照片，參照標(biāo)準(zhǔn)[7]進行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colonmucosa damage index，CMDI)評分。

2.5結(jié)腸組織MPO、EGF和TGF-β1含量的檢測切取病變嚴(yán)重區(qū)域結(jié)腸組織0.15 g，按1 ∶9(W/V)生理鹽水勻漿，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，用試劑盒檢測上清液中MPO、EGF、TGF-β1的含量。

2.6結(jié)腸組織HS評分剩余結(jié)腸用40 g·L-1甲醛固定，制作病理切片，并參照標(biāo)準(zhǔn)[8]進行病理組織學(xué)(histopathological score，HS)評分。

3　結(jié)果

3.1康復(fù)新液對UC大鼠DAI評分的影響實驗期間，正常組大鼠反應(yīng)靈活，進食正常，無腹瀉及血便，大便呈球形或條形，未出現(xiàn)異常情況。其余大鼠自造模后d 1均出現(xiàn)不同程度的厭食、懶動、體重下降、大便隱血或血便。d 7進行分組后的各組大鼠DAI評分組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明各造模組大鼠炎癥程度具有一致性，而與正常組比較差異均有顯著性(P<0.01)。給藥前期，模型組大鼠(生理鹽水灌腸)血便、腹瀉加重，體重下降明顯，后期有所緩解，糞便逐漸轉(zhuǎn)為松散，并且體重有回升的趨勢。末次給藥結(jié)束后(d 21)，模型組大鼠DAI評分仍明顯高于正常組(P<0.01)，經(jīng)SASP和康復(fù)新液治療的大鼠癥狀恢復(fù)較快，SASP組和康復(fù)新液各劑量組DAI評分明顯低于模型對照組(P<0.01)。不同時間點大鼠的DAI分值見Tab 1。

3.2康復(fù)新液對UC大鼠臟器指數(shù)、結(jié)腸長寬及

Tab 1　Effect of Kangfuxin liquid on DAI score of UC rats (±s, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel;ΔP<0.05vsSASP

Tab 2　Effect of Kangfuxin liquid on colon and CMDI score of UC rats (±s, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

CMDI評分的影響末次給藥次日(造模后d 22)，正常組、模型組與各給藥組在肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)上并無顯著性差異。正常組大鼠肉眼觀察結(jié)腸黏膜無明顯水腫、糜爛和潰瘍形成。模型組大鼠腸壁可見明顯的充血和水腫，結(jié)腸明顯縮短(P<0.05或P<0.01)；沿腸系膜縱向剖開可見腸壁黏膜有散在的潰瘍點和糜爛，病變主要累及遠端結(jié)腸，CMDI評分升高(P<0.01)。SASP組和康復(fù)新液各劑量組大鼠腸黏膜病變較模型對照組明顯好轉(zhuǎn)，結(jié)腸指數(shù)均明顯降低(P<0.01)。見Tab 2。

3.3康復(fù)新液對UC大鼠血清IL-4和IL-17含量的影響如Fig 1所示，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-4含量明顯降低(P<0.01)、IL-17含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，SASP組和康復(fù)新液各劑量組大鼠血清IL-4含量均不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，而康復(fù)新液高劑量組IL-17含量明顯降低(P<0.05)。

3.4康復(fù)新液對UC大鼠結(jié)腸組織MPO、EGF和TGF-β1含量的影響如Fig 2所示，與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸MPO含量明顯升高(P<0.01)，EGF和TGF-β1含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，SASP組及康復(fù)新液中、高劑量組大鼠結(jié)腸MPO含量明顯降低(P<0.01)，EGF和TGF-β1含量不同程度升高(P<0.05或P<0.01)。

3.5康復(fù)新液對UC大鼠結(jié)腸組織HS評分的影響顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理切片，正常對照組黏膜上皮完整，可見杯形細胞，隱窩形態(tài)正常，炎細胞浸潤不明顯；其余各造模組大鼠結(jié)腸黏膜上皮可見不同程度的破損、杯狀細胞和隱窩大量丟失，黏膜層和黏膜肌層炎性細胞大量浸潤，并伴有明顯水腫(Fig 3)。模型組HS評分明顯高于正常組(P<0.01)，SASP組和康復(fù)新液各劑量組HS評分均較模型組不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，且康復(fù)新液高劑量組與SASP組效果相當(dāng)。

4　討論

潰瘍性結(jié)腸炎病因和發(fā)病機制尚不明確，可能由遺傳、環(huán)境、免疫等多因素相互作用導(dǎo)致。CD4+T細胞根據(jù)其功能分為Th1和Th2亞群，Th1細胞促進機體免疫反應(yīng)，促進炎癥發(fā)生，Th2則降低機體的免疫反應(yīng)，T細胞的分化由Th1/Th2細胞因子誘導(dǎo)，Th1與Th2細胞平衡狀態(tài)的破壞會導(dǎo)致免疫功能紊亂[9]。TNBS誘導(dǎo)SD大鼠的UC模型具有重復(fù)性好、造模時間短、炎癥維持時間長等特點，并以引起Th1介導(dǎo)的反應(yīng)為主，其組織學(xué)改變的許多特點與人類相似，被廣泛用于結(jié)腸炎的藥物研究[10]。

Fig 1　Changes of serum levels of IL-4 and IL-17 in rats (n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;ΔP<0.05vsSASP

IL-4為Th2細胞因子，可誘導(dǎo)T細胞向Th2型分化，是抑制炎癥反應(yīng)和維持腸道免疫平衡的抗炎因子[11]。TGF-β1是一種具有較強抗炎作用的多效細胞因子，其主要作用是抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞生長、增強免疫等[12]。本實驗中，模型組血清IL-4含量、結(jié)腸組織TGF-β1明顯低于正常組，提示TNBS誘導(dǎo)Th1型UC可能是因為該模型中Th2細胞因子IL-4的減少，導(dǎo)致Th1/Th2失衡。而康復(fù)新液可以使IL-4、TGF-β1水平升高，提示康復(fù)新液可調(diào)節(jié)抑炎因子的表達，使機體免疫功能重新恢復(fù)平衡狀態(tài)。

Fig 3　Representative HE-stained colon sections(×100)

A: Normal; B: Model; C: SASP; D: KFX-low; E: KFX-medium; F: KFX-high

IL-17由Th17細胞分泌，具有較強激活嗜中性粒細胞能力，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生和組織損傷[13]。MPO由中性粒細胞分泌，其活性是中性粒細胞浸潤的重要指標(biāo)，也能間接反映腸道炎癥活動程度，并可促進炎癥部位細胞損傷[14]。本實驗?zāi)Ｐ徒M中IL-17、MPO的表達明顯升高，腸黏膜有大量炎性細胞浸潤。而康復(fù)新液給藥能明顯下調(diào)IL-17、MPO含量，改善黏膜病理結(jié)構(gòu)，提示康復(fù)新液可抑制中性粒細胞浸潤、抑制炎癥因子釋放，從而限制炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

EGF具有誘導(dǎo)細胞分化、刺激組織生長修復(fù)、維持上皮細胞新陳代謝等重要功能[15]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組EGF含量低于正常組，藥物組均較模型組明顯升高，提示康復(fù)新液可促進病變部位修復(fù)。

綜上所述，康復(fù)新液對大鼠UC炎癥有緩解作用，通過調(diào)節(jié)促炎因子與抑炎因子使到達平衡，抑制機體炎癥，改善結(jié)腸組織病理變化，促進腸黏膜修復(fù)。

(致謝：大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院部分碩士研究生、教師及大理州第一人民醫(yī)院病理科戴莉萍老師、陳瑩老師曾參與承擔(dān)本課題工作，謹(jǐn)此致謝。)

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