秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型在肌肉萎縮癥研究中的應(yīng)用

馬淑梅，劉　莉

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評(píng)價(jià)研究中心，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市生物物質(zhì)成藥性評(píng)價(jià)專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上?！?00437)

肌肉萎縮癥是一種慢性進(jìn)行性疾病，其病因?yàn)榫幋a特定肌細(xì)胞蛋白的基因發(fā)生突變，目前已知至少21種單基因突變可導(dǎo)致肌肉萎縮[1]。杜氏肌肉萎縮(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是最為常見(jiàn)的類(lèi)型，是一種X染色體隱性遺傳疾病，每年大約有1/3 500的男性新生兒罹患此病[2]。

患者會(huì)出現(xiàn)肌細(xì)胞壞死和肌無(wú)力致無(wú)法活動(dòng)等癥狀，目前只能通過(guò)物理方法和甾體類(lèi)激素進(jìn)行姑息治療。在臨床前研究中，可用的肌肉萎縮動(dòng)物模型有小鼠、犬等，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)以通體透明、生命周期短、基因與人類(lèi)基因具有高度同源性等優(yōu)勢(shì)得到研發(fā)人員的關(guān)注。目前線(xiàn)蟲(chóng)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、衰老、真菌感染等領(lǐng)域藥物的研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用[3-4]。本文就秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在肌肉萎縮研究中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)。

1　肌肉萎縮秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型

線(xiàn)蟲(chóng)是一種個(gè)體小、生活周期短、容易繁殖后代、體細(xì)胞數(shù)目固定且特定細(xì)胞位置固定的簡(jiǎn)單動(dòng)物。1963年，Brenner[5]首次提出應(yīng)用線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究，1974年，他通過(guò)EMS誘變獲得300多個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)突變體，開(kāi)始用線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行分子和發(fā)育生物學(xué)的研究。2000年，Gieseler等[6]為了尋找通過(guò)錯(cuò)誤表達(dá)可以抑制肌肉萎縮表型的基因，首次建立了肌肉萎縮線(xiàn)蟲(chóng)模型。此后，許多研究人員利用線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行肌肉萎縮研究。

1.1可用于肌肉萎縮研究的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型基因突變株線(xiàn)蟲(chóng)基因組中含有人類(lèi)抗肌萎縮蛋白類(lèi)似基因dys-1，dys-1基因突變線(xiàn)蟲(chóng)伴有運(yùn)動(dòng)能力下降、頭部過(guò)度彎曲等行為學(xué)改變，但不會(huì)出現(xiàn)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等肌肉萎縮癥狀[7]。研究表明，只缺失抗肌肉萎縮蛋白基因的mdx小鼠僅表現(xiàn)出輕微的肌肉萎縮癥狀，而同時(shí)缺失抗肌萎縮蛋白基因和生肌因子基因MyoD的小鼠會(huì)表現(xiàn)出類(lèi)似人類(lèi)肌肉萎縮的嚴(yán)重癥狀[8]，而線(xiàn)蟲(chóng)中與小鼠生肌因子基因MyoD對(duì)應(yīng)的基因?yàn)閔lh-1。Gieseler等[6]首次建立線(xiàn)蟲(chóng)肌肉萎縮模型dys-1(cx18);hlh-1(cc561)突變株，該品系線(xiàn)蟲(chóng)可呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)的肌肉萎縮，表現(xiàn)出與人類(lèi)肌肉萎縮比較接近的癥狀，可用于抗肌肉萎縮藥物的篩選。胞內(nèi)鈣離子水平的增加會(huì)通過(guò)激活炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肌肉萎縮的進(jìn)程[9]。egl-19是線(xiàn)蟲(chóng)肌肉細(xì)胞中主要的電壓門(mén)控鈣通道，Mariol等[10]構(gòu)建了dys-1；egl-19雙突變的線(xiàn)蟲(chóng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，egl-19基因功能獲得性突變的dys-1線(xiàn)蟲(chóng)突變株隨著年齡的增加會(huì)出現(xiàn)過(guò)度收縮、頭部過(guò)度彎曲以及運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)等肌肉萎縮癥狀，dys-1(cx18);egl-19(ad695)線(xiàn)蟲(chóng)突變株的體壁肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致肌肉萎縮。unc-9基因編碼線(xiàn)蟲(chóng)體壁細(xì)胞間隙連接蛋白，UNC-9蛋白表達(dá)于肌細(xì)胞臂和細(xì)胞間連接部位，是間隙連接的重要組成成分。線(xiàn)蟲(chóng)體壁肌細(xì)胞通過(guò)間隙連接進(jìn)行電緊張偶合，UNC-9蛋白缺失，使得肌細(xì)胞不能接受來(lái)自神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)，因此，unc-9基因突變的線(xiàn)蟲(chóng)幾近癱瘓[11]。

1.2應(yīng)用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)突變株進(jìn)行肌肉萎縮研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)爬行是線(xiàn)蟲(chóng)在瓊脂培養(yǎng)皿上的主要運(yùn)動(dòng)方式，因此許多研究者用爬行實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)線(xiàn)蟲(chóng)神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的完整性，但線(xiàn)蟲(chóng)模型在爬行實(shí)驗(yàn)中僅表現(xiàn)出不明顯的肌肉萎縮疾病表型，因此，爬行實(shí)驗(yàn)阻礙了線(xiàn)蟲(chóng)模型在部分神經(jīng)肌肉紊亂研究中的應(yīng)用。由于線(xiàn)蟲(chóng)在土壤基質(zhì)中大部分時(shí)間都在挖掘，研究人員[12]將線(xiàn)蟲(chóng)溶液注入瓊脂預(yù)填充的10 mL塑料移液管距一端1 cm處，用保鮮蠟?zāi)し忾]，塑料移液管的另一端放置誘引劑丁二酮，用照相機(jī)拍攝線(xiàn)蟲(chóng)挖掘過(guò)程，計(jì)數(shù)每組到達(dá)距離誘引劑4 cm處的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)目，以判斷不同線(xiàn)蟲(chóng)突變株的挖掘能力，進(jìn)行挖掘?qū)嶒?yàn)，同時(shí)，以頭彎曲頻率、速率、回旋率、歐米伽彎曲等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)線(xiàn)蟲(chóng)在肌肉萎縮研究中的運(yùn)動(dòng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，挖掘?qū)嶒?yàn)中線(xiàn)蟲(chóng)可以很好地模擬人類(lèi)肌肉萎縮表型。線(xiàn)蟲(chóng)在液體培養(yǎng)基中的主要運(yùn)動(dòng)方式為游行[13]，游行與爬行具有不同的運(yùn)動(dòng)特征，或可應(yīng)用線(xiàn)蟲(chóng)游泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗肌肉萎縮藥物篩選。此外，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以用于模擬微重力對(duì)細(xì)胞功能的影響相關(guān)研究。因此，有研究者應(yīng)用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)模擬太空飛行微重力環(huán)境對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體壁肌結(jié)構(gòu)和功能的影響，以探索太空飛行微重力所致肌肉萎縮的發(fā)病機(jī)制[14]。

1.3利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行抗肌萎縮藥物篩選研究2004年，Gaud等[15]應(yīng)用dys-1(cx18);hlh-1(cc561)線(xiàn)蟲(chóng)突變株篩選了約100個(gè)化合物對(duì)肌肉萎縮的治療作用，考察藥物作用后線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)學(xué)變化和肌細(xì)胞退化情況?；衔锶芤号c培養(yǎng)基混合至終濃度為1 g·L-1或者最大溶解度，使成年dys-1(cx18);hlh-1(cc561)線(xiàn)蟲(chóng)突變株在含化合物的培養(yǎng)基上產(chǎn)卵過(guò)夜，之后將成蟲(chóng)移除，蟲(chóng)卵在15℃、食物充足情況下培養(yǎng)7 d，化合物通過(guò)表皮滲透和攝食進(jìn)入線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)，這種給藥方法可以使線(xiàn)蟲(chóng)持續(xù)暴露于化合物。固定并透化線(xiàn)蟲(chóng)，與羅丹明-鬼筆環(huán)肽共孵育以對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體壁肌細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)染色異常的肌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)的松能降低40%抗肌萎縮蛋白缺陷的肌細(xì)胞的退化。該研究表明，線(xiàn)蟲(chóng)可以作為篩選抗肌肉萎縮化合物的工具。

之后，又有研究人員Carre-Pierrat等[16-17]利用線(xiàn)蟲(chóng)肌萎縮模型研究神經(jīng)激素5-羥色胺及其激動(dòng)劑以及1 000多個(gè)已批準(zhǔn)上市的化合物進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mmol·L-15-羥色胺處理的線(xiàn)蟲(chóng)活動(dòng)能力有所改善，體壁肌細(xì)胞的退化明顯降低，劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2.5 mmol·L-15-羥色胺仍具有延緩肌肉萎縮進(jìn)展的作用。應(yīng)用5-羥色胺激動(dòng)劑以及5-羥色胺重?cái)z取蛋白抑制劑得到相似的結(jié)果。另外，醋甲唑胺0.5 g·L-1和雙氯非那胺0.1 g·L-1能明顯改善線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力并減少肌細(xì)胞的退化。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，醋甲唑胺或雙氯非那胺通過(guò)與線(xiàn)蟲(chóng)醋酸酐酶CAH-4相互作用改善肌肉萎縮進(jìn)展，該結(jié)果在mdx小鼠模型中得到驗(yàn)證。這表明肌肉萎縮線(xiàn)蟲(chóng)模型聯(lián)合mdx小鼠模型驗(yàn)證策略可用于篩選有效的抗肌肉萎縮藥物。

Tab 1　Screening of anti-muscular atrophy drugs using C.elegans

本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用dys-1(cx18);hlh-1(cc561)線(xiàn)蟲(chóng)突變株對(duì)數(shù)個(gè)具有抗氧化活性的中藥提取物進(jìn)行篩選，部分中藥提取物可明顯改善線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力，接下來(lái)將考察這些提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)肌細(xì)胞數(shù)目及健康情況的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1.4利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)肌肉萎縮發(fā)病機(jī)制相關(guān)信號(hào)通路的研究Oh等[18]發(fā)現(xiàn)，抗肌萎縮蛋白缺失并不直接導(dǎo)致肌細(xì)胞的死亡，而是使肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，dys-1線(xiàn)蟲(chóng)突變株肌細(xì)胞的存活或者死亡決定于年齡依賴(lài)的細(xì)胞微環(huán)境。因此，提供一個(gè)持續(xù)更新的細(xì)胞微環(huán)境可能成為防止抗肌萎縮蛋白功能缺失的肌細(xì)胞死亡的一種途徑。研究表明[19]，IGF信號(hào)降低可通過(guò)daf-16提高應(yīng)激耐受，延遲固有蛋白聚集，延長(zhǎng)壽命。Oh等先后構(gòu)建了肌細(xì)胞表達(dá)GFP的daf-2(e1370)；dys-1和daf-2(e1370)；daf-16(mu86)；dys-1線(xiàn)蟲(chóng)突變株，得到IGF受體表達(dá)下調(diào)的線(xiàn)蟲(chóng)株，評(píng)估該線(xiàn)蟲(chóng)株肌細(xì)胞的健康情況并檢測(cè)其壽命。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，daf-2(e1370)；dys-1線(xiàn)蟲(chóng)突變株肌細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)聚集的GFP信號(hào)，daf-2(e1370)；dys-1線(xiàn)蟲(chóng)突變株壽命與daf-2(e1370)線(xiàn)蟲(chóng)壽命相當(dāng)，而daf-2(e1370)；daf-16(mu86)；dys-1線(xiàn)蟲(chóng)突變株肌細(xì)胞出現(xiàn)聚集的GFP信號(hào)，并且細(xì)胞核數(shù)量減少，這表明抑制IGF信號(hào)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)肌細(xì)胞的保護(hù)作用依賴(lài)于daf-16。抑制IGF信號(hào)通路能夠減少daf-16依賴(lài)的dys-1基因突變線(xiàn)蟲(chóng)肌肉細(xì)胞的死亡。這提示，抑制IGF信號(hào)通路的化合物可能具有治療肌肉萎縮的潛力。Lecroisey等[20]發(fā)現(xiàn)斑聯(lián)蛋白ZYX-1參與抗肌萎縮蛋白依賴(lài)的線(xiàn)蟲(chóng)肌肉萎縮，通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)ZYX-1的dys-1(cx-18)；hlh-1(cc561)線(xiàn)蟲(chóng)突變株和ZYX-1功能缺失的dys-1(cx-18)；hlh-1(cc561)；zyx-1(gk190)線(xiàn)蟲(chóng)突變株，應(yīng)用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色計(jì)數(shù)線(xiàn)蟲(chóng)肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ZYX-1的線(xiàn)蟲(chóng)和ZYX-1功能缺失的線(xiàn)蟲(chóng)肌細(xì)胞損傷數(shù)目分別降低35%和60%，這表明ZYX-1促進(jìn)dys-1(cx-18)；hlh-1(cc561)線(xiàn)蟲(chóng)突變株肌細(xì)胞退化。Catoire等[21]研究發(fā)現(xiàn)，突變的多聚丙氨酸結(jié)合蛋白1(PABPN1)導(dǎo)致成年線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)生肌肉萎縮，去乙?；窼ir2、轉(zhuǎn)錄因子Foxo、AMPK共同調(diào)節(jié)PABPN1的毒性，因此，抑制Sir2或AMPK可能成為治療肌肉萎縮的新策略。

2　肌肉萎縮小鼠模型和犬模型

2.1mdx小鼠模型抗肌萎縮蛋白，編碼基因長(zhǎng)度2.2 Mb，由79個(gè)主要外顯子和6個(gè)可變第一外顯子組成。mdx小鼠有5種不同的突變類(lèi)型[22]，每一種突變模型都會(huì)造成骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)功能異常的抗肌萎縮蛋白。mdx小鼠的骨骼肌細(xì)胞大約在3周齡時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)退化，大約7周齡時(shí)出現(xiàn)大面積的肌肉壞死，同時(shí)伴有肌肉退化和再生。然而，與患者相比，mdx小鼠的肌萎縮癥狀較輕。mdx小鼠不出現(xiàn)明顯的壞死和關(guān)節(jié)攣縮，并且隨著時(shí)間推移僅部分骨骼肌纖維被脂肪細(xì)胞取代。DMD患者的肌腱連接嚴(yán)重受損，而mdx小鼠中僅出現(xiàn)輕微改變。另外，在mdx小鼠中，神經(jīng)肌肉突觸中突觸折疊的缺失對(duì)突觸傳遞沒(méi)有影響，而對(duì)于患者來(lái)說(shuō)具有重大影響。由于mdx小鼠的壽命比正常小鼠僅縮短約20%，因此不能用mdx小鼠模型來(lái)進(jìn)行不同治療策略延長(zhǎng)壽命的試驗(yàn)。

2.2mdx:utrn-/-小鼠模型導(dǎo)致mdx小鼠肌肉萎縮癥狀輕微的原因可能有：小鼠比人小并且弱，因此在傳遞肌力時(shí)對(duì)抗肌萎縮蛋白的依賴(lài)較人類(lèi)?。慌cDMD患者相比，mdx小鼠中衛(wèi)星細(xì)胞較好的保持了其再生能力；在mdx小鼠中同源蛋白有效地補(bǔ)償了抗肌萎縮蛋白的缺失?；诖?，研究人員制備了抗肌萎縮蛋白和抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白雙缺失的嚴(yán)重肌萎縮模型[23]。

抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白(utrophin)，分子質(zhì)量376 ku，是抗肌萎縮蛋白同系物?？辜∥s蛋白相關(guān)蛋白是由全長(zhǎng)的異構(gòu)體組成，這兩個(gè)異構(gòu)體具有不同的啟動(dòng)子，并且其N(xiāo)端起始外顯子不同。抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A表達(dá)于橫紋肌、脈絡(luò)膜叢、軟腦膜和腎小球?？辜∥s蛋白相關(guān)蛋白B表達(dá)于血管。在胚胎發(fā)育期，抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A貫穿于整個(gè)肌纖維膜，在產(chǎn)后發(fā)育階段，抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A僅存在于神經(jīng)肌肉和肌腱連接處。在mdx小鼠模型中，抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A的表達(dá)增加，并且在肌纖維膜上可見(jiàn)低水平的抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A表達(dá)。抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白通過(guò)維持肌動(dòng)蛋白骨架和肌纖維膜上DGC的相互作用，功能性地補(bǔ)償了mdx小鼠抗肌萎縮蛋白缺失?？辜∥s蛋白相關(guān)蛋白表達(dá)水平越高，則患者必須借助輪椅的時(shí)間越推后。目前，研究人員正在尋找可以提高肌纖維膜抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白表達(dá)的藥物來(lái)治療肌肉萎縮癥。

mdx:utrn-/-小鼠比野生型小鼠小，嚴(yán)重駝背，隨著年齡的增加行動(dòng)力下降。運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，大量的骨骼肌纖維被纖維組織取代從而導(dǎo)致攣縮。肌肉部位也變成脂肪組織。與野生型小鼠和mdx小鼠相比，其骨骼肌較小較弱，并且在肌肉收縮時(shí)易被損傷。其神經(jīng)肌肉連接不完整，突觸后折疊明顯減少。在肌腱連接處，終端肌小節(jié)很少與肌腱直接連接。mdx:utrn-/-小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌病變。20周齡內(nèi)死亡。mdx:utrn-/-小鼠的病理程度和壽命與DMD患者較為相似，因此，成為檢測(cè)肌肉萎縮癥治療方法的一種較為適合的模型。

2.3肌肉萎縮犬模型犬類(lèi)X連鎖肌肉萎縮癥模型有金獵犬(golden retriever, GRMD)、羅特韋爾犬和德國(guó)短毛犬模型。其中，GRMD犬在日本被培育成比格犬，稱(chēng)為cxmdj。cxmdj與GRMD犬具有相同的點(diǎn)突變和相似的表型。最常用的模型為GRMD犬模型[24]。

犬類(lèi)X連鎖肌肉萎縮癥模型與DMD病理過(guò)程相似。選擇性肌肉退化的早期，新生GRMD犬的死亡率很高。渡過(guò)新生兒期的犬會(huì)出現(xiàn)肌纖維再生和大面積炎癥反應(yīng)，一些肌肉部位出現(xiàn)高濃度的結(jié)晶鈣并且呈透明狀。大約2月齡時(shí)，肌纖維被纖維組織和脂肪細(xì)胞取代。6月齡出現(xiàn)明顯地關(guān)節(jié)攣縮，運(yùn)動(dòng)能力嚴(yán)重受損，肌肉萎縮、變?nèi)跚乙驯皇湛s損傷。GRMD犬會(huì)出現(xiàn)心肌病變和呼吸窘迫而死亡。與其他哺乳動(dòng)物比較，cxmdj；犬具有與人類(lèi)免疫系統(tǒng)類(lèi)似的免疫系統(tǒng)，可對(duì)外源性物質(zhì)做出類(lèi)似人類(lèi)的免疫反應(yīng)[25]。但是由于人類(lèi)肌萎縮的病理過(guò)程在犬類(lèi)模型中沒(méi)有合適的功能性治療效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，且價(jià)格昂貴，易于死亡，因此應(yīng)用于抗肌萎縮藥物的篩選仍面臨較大挑戰(zhàn)。

3　小結(jié)

肌肉萎縮癥是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，目前尚無(wú)有效的治療方法，尋找一種經(jīng)濟(jì)、快速的藥物篩選方法對(duì)肌肉萎縮癥的治療至關(guān)重要。mdx小鼠和犬類(lèi)X連鎖肌肉萎縮癥模型各具優(yōu)勢(shì)，但成本較高。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)作為整體動(dòng)物模型，克服了細(xì)胞篩選對(duì)樣品的限制，同時(shí)，以突變體或者轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的線(xiàn)蟲(chóng)疾病模型都具有明確的分子基礎(chǔ)，一旦化合物的活性被確定，相關(guān)的分子機(jī)制即可闡明。因此，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在抗肌萎縮藥物毒性評(píng)價(jià)以及藥物篩選方面具有不可替代的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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