工業(yè)生產(chǎn)螺旋霉素發(fā)酵染菌罐批處理工藝

劉繼方,徐 虹,李明麗

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西 楊陵 712100; 2.天方藥業(yè)有限公司,河南 駐馬店 463000)

Perlnan[2]總結(jié)經(jīng)驗(yàn)時(shí)指出："在大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵中，微生物污染是主要關(guān)心的難題，采用許多工程技術(shù)于培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌。發(fā)酵染菌機(jī)會(huì)少于2%，這一指標(biāo)是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)錢的發(fā)展項(xiàng)目……。"我國(guó)的經(jīng)驗(yàn)也是如此。童村和濃義[3]在青霉素工業(yè)生產(chǎn)中，經(jīng)過(guò)5～6年的努力，才把青霉素工業(yè)發(fā)酵的染菌率降低至2%以下。為了保證發(fā)酵生產(chǎn)正常進(jìn)行，應(yīng)盡可能避免雜菌污染。發(fā)酵罐的染菌不僅降低發(fā)酵的總體生產(chǎn)水平，也會(huì)增加發(fā)酵生產(chǎn)成本，同時(shí)還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。

染菌是影響和制約發(fā)酵法生產(chǎn)抗生素的關(guān)鍵因素之一，生物發(fā)酵染菌的控制在工程與方法[4]上較為成熟，但對(duì)于處理補(bǔ)救不同品種之間、同品種不同染菌時(shí)間的染菌罐批的方法差異較大，如處理不合適則會(huì)影響到發(fā)酵液組分，進(jìn)而造成更大的原材料、能源等浪費(fèi)。對(duì)于螺旋霉素發(fā)酵染菌罐批的補(bǔ)救工藝，本作者總結(jié)了本單位2500m3發(fā)酵噸位規(guī)模的長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，就螺旋霉素發(fā)酵前期染菌，從營(yíng)養(yǎng)料液的成分、補(bǔ)加量等方面探索，總結(jié)出符合螺旋霉素發(fā)酵染菌罐批的補(bǔ)救處理工藝，使得染菌罐批放罐效價(jià)不低于生產(chǎn)平均水平、發(fā)酵液組分滿足企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 菌種

螺旋霉素鏈霉菌菌株生二素灰色鏈霉菌，由天方藥業(yè)有限公司菌種中心提供。

1.2 設(shè)備、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

150m3發(fā)酵罐，各級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。天方藥業(yè)有限公司螺旋霉素生產(chǎn)車間生產(chǎn)狀態(tài)。

1.3 檢測(cè)方法

效價(jià)的測(cè)定采用紫外分光光度法；

總糖含量測(cè)定采用菲林法；

氨基氮測(cè)定采用甲醛滴定法；

菌體濃度采用離心法；

pH值的測(cè)量采用在線檢測(cè)。

1.4 試驗(yàn)方法

選用發(fā)酵車間正常生產(chǎn)過(guò)程前期染菌(10～30h染菌)罐批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)總糖、氨基氮、pH值在內(nèi)控指標(biāo)范圍內(nèi)。確定實(shí)驗(yàn)罐體積后將部分染菌料液與正常培養(yǎng)基按不同比例混合，調(diào)整料液pH值，然后企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行滅菌、接種、培養(yǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳返消體積比

發(fā)酵罐染菌后由于雜菌的生長(zhǎng)、代謝，利用消耗部分培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)并產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì)等影響培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的比例構(gòu)成及酸堿平衡。染菌罐(前期染菌，下同)直接返消的往往會(huì)菌種生長(zhǎng)、代謝異常、效價(jià)低、雜質(zhì)多。從圖1、圖2可以看出：返消料占發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比越低，菌絲生長(zhǎng)代謝、效價(jià)、總組分越接近正常罐批，隨著體積比增大到60%時(shí)效價(jià)明顯降低，此時(shí)發(fā)酵過(guò)程pH回升、氨基氮消耗異常，返消料體積比50%為染菌罐批料液處理的臨界點(diǎn)。

圖1 返消料體積比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 體積比臨界pH變化趨勢(shì)圖

2.2 返消pH值

圖3 構(gòu)建KH2PO4、CaCO3

培養(yǎng)基的pH值不僅影響螺旋霉素產(chǎn)生菌生長(zhǎng)，也影響著螺旋霉素代謝合成[5]。染菌后培養(yǎng)基成分變化復(fù)雜，pH緩沖體系被破壞，造成發(fā)酵過(guò)程pH較正產(chǎn)罐批難控制。為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常要進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，pH的調(diào)節(jié)包括pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)和pH的外源調(diào)節(jié)。外源調(diào)節(jié)是在培養(yǎng)過(guò)程中可以通過(guò)調(diào)整補(bǔ)料來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值[6]，內(nèi)源調(diào)節(jié)返消時(shí)構(gòu)建KH2PO4、CaCO3緩沖體系，從圖3可以看出：構(gòu)建KH2PO4、CaCO3pH緩沖體系夠穩(wěn)定控制發(fā)酵過(guò)程pH，通過(guò)補(bǔ)料進(jìn)行外源調(diào)節(jié)控制難度大，pH波動(dòng)明顯；從圖4可以看出：通過(guò)補(bǔ)料進(jìn)行外源調(diào)節(jié)pH補(bǔ)料量大，成本較高，在大規(guī)模生產(chǎn)中意義不大。

圖4 調(diào)節(jié)pH補(bǔ)料量的變化趨

3 結(jié)論

(1)發(fā)酵液染菌是抗生素發(fā)酵生產(chǎn)的一大難題，是無(wú)法回避的困難，對(duì)于發(fā)酵罐前期染菌可以通過(guò)返消處理染菌的培養(yǎng)基，返消料與發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積比越大染菌料液利用率越大，但對(duì)效價(jià)影響越明顯，到60%為臨界點(diǎn)，在生產(chǎn)中取50%體積比最大程度處理利用染菌罐批，且發(fā)酵過(guò)程pH控制穩(wěn)定，效價(jià)影響較少。

(2)返消時(shí)構(gòu)建KH2PO4、CaCO3pH緩沖體系較通過(guò)補(bǔ)料調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程pH值更穩(wěn)定，發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)料量節(jié)約20m3/批。