蘭文婷,金若蕓,劉耀文,王淑瑤,馬東輝,何利
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)
草魚(Ctenopharyngodonidellus)是中國(guó)產(chǎn)量最大的淡水魚之一,年產(chǎn)量超過(guò)300萬(wàn)t,占淡水魚總產(chǎn)量的20%,在加工過(guò)程中魚皮魚鱗等副產(chǎn)物利用率較低,造成極大的資源浪費(fèi)。魚皮、魚鱗中含有豐富的膠原蛋白,它具有安全易得等特點(diǎn),是一種較好的可再生生物資源[1]。膠原蛋白可應(yīng)用于功能性材料、食品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[2]。其中含量最多、應(yīng)用最為廣泛的是I型膠原蛋白,其3條多肽鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)有很高的抗張強(qiáng)度。有研究報(bào)道I型膠原蛋白分子在中性溶液中和室溫下可以在體外自發(fā)聚集成原纖維,通過(guò)自聚集能提高膠原基材料的比表面積、耐酶降解性以及熱穩(wěn)定性[3-4]。不同原料中提取得到的膠原蛋白在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上存在差異[5],可能在自聚集過(guò)程中形成不同的微觀結(jié)構(gòu),從而影響在生物材料中的應(yīng)用。因此本文以草魚鱗與草魚皮為原料,經(jīng)酸-酶結(jié)合法提取膠原蛋白,在對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)表征的基礎(chǔ)上,開(kāi)展自聚集行為的比較研究,力圖揭示草魚鱗與草魚皮膠原蛋白自聚集行為的差異性,為不同來(lái)源I型膠原蛋白在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
10月于四川省雅安市蒼平山農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買重1.5 kg左右的鮮活草魚,取魚鱗與魚皮進(jìn)行脫脂(魚鱗還需進(jìn)行脫鈣),去除雜蛋白、色素處理,洗凈瀝干,備用[6-7]。
胃蛋白酶(BR 10 000 U/g),購(gòu)于上海瑞永公司;十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R-250,購(gòu)于Bio Basic公司;3H2O·N-對(duì)甲苯磺酰胺鈉鹽(氯胺T)、高氯酸、對(duì)二甲氨基苯甲醛及其他常見(jiàn)試劑等均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠。
Milli-Q超純水系統(tǒng),美國(guó)密理博公司;Thermo BR4i 型冷凍離心機(jī),美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;PB-2B pH計(jì),北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng),美國(guó)Bio-RAD公司;NICOLET iS 10型傅里葉變換紅外光譜儀,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;Q200差示掃描量熱儀DSC,美國(guó)TA儀器公司;Thermo PL3000冷凍干燥機(jī),美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;JSM-7500F型掃描電鏡,日本電子公司;UV-1800PC型紫外分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司。
1.3.1 膠原蛋白的提取與純化
參考李國(guó)輝、熊善柏的方法[6-7],在4 ℃條件下,以0.5 mol/L醋酸作為介質(zhì),胃蛋白酶用量2 000 U/g提取魚皮、魚鱗中的膠原蛋白。酶解液抽濾,濾液于10 000 r/min,4 ℃下離心30 min,取上清液邊攪拌邊加入固體NaCl鹽析,4 ℃靜置過(guò)夜,10 000 r/min冷凍離心20 min,收集沉淀,以0.5 mol/L醋酸復(fù)溶。復(fù)溶物用0.1 mol/L的醋酸透析24 h,超純水透析48 h,最后凍干得到純化的膠原蛋白樣品。
1.3.2 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)表征
通過(guò)紫外光譜(ultraviolet spectrum,UV)、傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)分析手段對(duì)純化后的膠原蛋白樣品結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行表征。
1.3.2.1 紫外光譜分析
將凍干的膠原蛋白溶于0.5 mol/L的醋酸,配成1 mg/mL膠原溶液,在190~400 nm進(jìn)行紫外掃描,確定樣品圖譜及紫外最大吸收波長(zhǎng)[8]。
1.3.2.2 FTIR分析
稱取1 mg樣品與1 g溴化鉀(KBr)混合研磨,于40 ℃下烘干后壓片,用紅外光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件:室內(nèi)溫度為25 ℃,掃描范圍:450~4 000 cm-1,掃描次數(shù):32,分辨率4 cm-1[9]。
1.3.2.3 SDS-PAGE分析
取5 mg樣品與5 mL SDS樣品緩沖液混合,于100 ℃加熱5 min,4 000 r/min離心10 min后取上清液20 μL點(diǎn)樣,選擇濃縮膠膠濃度為5%,分離膠膠濃度為12%,開(kāi)始電泳。使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。
1.3.2.4 DSC檢測(cè)
稱取膠原蛋白凍干樣品約3~5 mg,用鋁坩鍋封存。初始溫度20 ℃,在氮?dú)饬魉?0 mL/min條件下,以5 ℃的速率升至60 ℃,記錄吸熱曲線[7]。
1.3.3 膠原蛋白自聚集行為研究
1.3.3.1 濁度實(shí)驗(yàn)
參考YAN的方法[10],稱取凍干的膠原蛋白溶于0.5 mol/L的醋酸溶液中配成濃度為1 mg/mL初始膠原蛋白溶液,取10 mL置于透析袋中,在pH 7.0含150 mmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析24 h,取3 mL透析袋內(nèi)樣品在30 ℃水浴,于310 nm處測(cè)定其吸光度值,并繪制吸光度隨時(shí)間變化的濁度曲線。
1.3.3.2 聚集程度的測(cè)定
樣品按1.3.3.1方法透析后于30 ℃水浴條件下自聚集10 h,參考ZHANG的方法[11],4 ℃下經(jīng)12 000 r/min離心30 min后取上清液測(cè)定其羥脯氨酸含量[12],同時(shí)測(cè)定1.3.6中初始膠原蛋白溶液中羥脯氨酸含量。根據(jù)羥脯氨酸含量變化計(jì)算聚集程度,公式如下:
(1)
式中:A,膠原聚集程度,%;a,膠原聚集前羥脯氨酸的含量,%;b,膠原聚集后羥脯氨酸的含量,%。
1.3.3.3 SEM表征
樣品按1.3.3.1方法透析后于30 ℃水浴條件下自聚集10 h后,4 ℃下經(jīng)12 000 r/min離心20 min后取沉淀部分25 μL滴于剛剝離的云母片上(1 cm×1 cm),經(jīng)初步干燥后滴加少量蒸餾水清洗鹽結(jié)晶,于室溫下干燥,同時(shí)將1.3.3.1中初始膠原蛋白溶液滴于云母片上制備對(duì)照樣品。用乙醇梯度脫水、冷凍干燥,噴金處理后觀察自聚集前后結(jié)構(gòu)的變化[13]。
圖1 草魚鱗與草魚皮膠原蛋白的紫外光譜圖Fig.1 UV spectrum of collagens from grass carp scale and skin
由紅外譜圖(圖2)可以看出,2種來(lái)源的膠原蛋白均具有I型膠原蛋白的5個(gè)特征吸收帶:酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶。酰胺A帶主要是由N—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生,吸收峰出現(xiàn)在3 400~3 440 cm-1[18],魚鱗、魚皮膠原蛋白的酰胺A帶分別在3 323 cm-1和3 322 cm-1處均小于3 400 cm-1,可能是由于NH基團(tuán)與氫鍵締合后,吸收峰發(fā)生藍(lán)移[19]。魚鱗、魚皮膠原蛋白的酰胺B帶分別在2 927 cm-1和2 925 cm-1處,這與CH2的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)有關(guān),此外魚皮在2 854 cm-1還存在CH2對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰[20]。魚皮和魚鱗的酰胺A帶、酰胺B帶有頻率、振幅的差異,表明兩種膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在不同[18,21],這種差異可能對(duì)膠原蛋白自聚集微觀形貌有一定影響。
圖2 草魚鱗與草魚皮膠原蛋白的紅外光譜圖Fig.2 Fourier-transform infrared spectra of collagens from grass carp scale and skin
I型膠原蛋白是由至少2條不同的α鏈(α1鏈和α2鏈)和1條β鏈組成[26]。由圖3可以看到,2種膠原蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量為120 kDa處含有2條α鏈,并且α1鏈的帶強(qiáng)度約為α2鏈的2倍,符合I型膠原蛋白[αl(I)]2α2(I)結(jié)構(gòu),同時(shí)在200 kDa處均有高分子質(zhì)量的β鏈(α鏈的二聚體)。在α2鏈下方無(wú)其他電泳帶,表明膠原蛋白未被水解為小分子組分,保持了膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)。用胃蛋白酶提取的膠原蛋白含α1、α2、β鏈?zhǔn)堑湫偷腎型膠原蛋白。
泳道1-標(biāo)準(zhǔn)蛋白;泳道2-草魚皮膠原蛋白;泳道3-草魚鱗膠原蛋白圖3 草魚鱗與草魚皮膠原蛋白的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE patterns of collagens
膠原蛋白的熱轉(zhuǎn)換是來(lái)自于膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)解體成隨機(jī)線圈,伴隨著黏度、沉降、擴(kuò)散等一系列物理變化。由圖4看到,魚皮膠原蛋白變性溫度為39.75 ℃,與鯰魚皮39.6 ℃[27]一致,但與喀拉魚皮35.19 ℃[28]相比有一定差異。這是由于一方面魚物體溫及其棲息地溫度可能對(duì)該物種膠原蛋白熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[29];另一方面膠原蛋白提取方法不同也會(huì)導(dǎo)致其穩(wěn)定性有些微差異[30]。魚鱗膠原蛋白變性溫度為34.49 ℃,與汪海波等[31]研究結(jié)果一致。魚皮膠原蛋白變性溫度高于魚鱗膠原蛋白,與LIU等[1]研究相吻合,這可能是由于不同組織來(lái)源的膠原蛋白亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量不同,從而導(dǎo)致膠原蛋白的熱穩(wěn)定性有一定差異[32]。
圖4 草魚鱗與草魚皮膠原蛋白的DSC圖譜Fig.4 DSC thermogram of collagens from grass carp scale and skin
濁度實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)310 nm處濁度的變化,對(duì)膠原蛋白自聚集進(jìn)行監(jiān)測(cè)。由圖5可以看到,在相同的自聚集條件下,2種來(lái)源的膠原蛋白均有自聚集能力,表現(xiàn)為濁度值隨時(shí)間逐漸增加。自聚集過(guò)程分為3個(gè)階段[33],成核期(此階段吸光度基本保持不變);自聚集期(此階段吸光度快速增加,膠原蛋白自聚集形成纖維);平衡期(吸光度達(dá)到最大值且保持恒定,揭示膠原纖維的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成)。由圖5中可以看出魚鱗成核期很短,說(shuō)明成核快速,能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速成核。魚皮有10 min的成核期,與趙燕等[13]報(bào)道一致,其濁度整體變化小于魚鱗,這可能由于魚鱗在自聚集時(shí)會(huì)快速產(chǎn)生類似于膠體的狀態(tài),致使其吸光度變化較大。
圖5 草魚鱗與草魚皮膠原蛋白的自聚集曲線Fig.5 Self-assembly curves of collagens from grass carp scale and skin
由圖5中可以看到在相同條件下經(jīng)過(guò)10 h的自聚集后,2種膠原蛋白的聚集程度較為接近,魚皮膠原蛋白為28%,魚鱗膠原蛋白為27.33%,而2種膠原蛋白在濁度實(shí)驗(yàn)中濁度變化差異較大,可能是由于聚集狀態(tài)與聚集微觀結(jié)構(gòu)不同所導(dǎo)致。不同物種來(lái)源的膠原蛋白在相同自聚集條件下聚集程度存在一定差異,而同一物種不同部位的膠原蛋白聚集程度十分接近,通過(guò)調(diào)節(jié)自聚集溫度、pH、鹽離子濃度等可提高膠原蛋白自聚集程度[4]。相同自聚集條件下,YAN對(duì)羅非魚皮膠原蛋白自聚集程度測(cè)定為19.6%[10],姚攀測(cè)得鳙魚皮膠原蛋白自聚集程度為35%,而隨著改變自聚集條件:適量升高溫度、pH,降低離子強(qiáng)度,延長(zhǎng)聚集時(shí)間,鳙魚皮膠原蛋白的聚集程度可達(dá)到80%[4],ZHANG對(duì)比貝斯特鱘魚魚皮與魚膘自聚集程度分別為92.5%與96%[11],本課題組對(duì)牛皮與牛肌腱中膠原蛋白聚集程度進(jìn)行測(cè)定分別為53%與59%。
草魚鱗及草魚皮膠原蛋白聚集前后的掃描電鏡圖如圖6所示,由圖6中以看到2種膠原蛋白聚集前都無(wú)序的分布在基底上形成多孔膜結(jié)構(gòu),其中草魚皮膠原蛋白膜結(jié)構(gòu)孔隙多且較大,草魚鱗膠原蛋白孔隙相對(duì)較少且存在少量的細(xì)小纖維;而聚集后則均出現(xiàn)纖維網(wǎng)狀聚集形貌。膠原蛋白聚集前后結(jié)構(gòu)的差異說(shuō)明自聚集行為可以顯著改變其超微結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)槟z原蛋白是典型的兩性分子擁有大量的親水性氨基酸,隨著中性鹽的加入膠原蛋白的水合層會(huì)被破壞,帶電殘基和疏水基團(tuán)暴露,從而因靜電力和疏水相互作用發(fā)生快速聚集[34]。2種膠原蛋白聚集后均形成相互交錯(cuò)的纖維,但其形貌存在一定差異。魚鱗膠原蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加明顯,可以清晰看到形狀分明的纖維狀聚集結(jié)構(gòu),并且SEM能觀測(cè)到其聚集后形成膠原原纖維的周期性橫紋D帶,具有較大的表面積。魚皮膠原蛋白形成的膠原纖維聚集形態(tài)周期性橫紋結(jié)構(gòu)不明顯,纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)雖呈一定坍塌狀態(tài),但聚集行為仍具有一定規(guī)模。膠原蛋白分子在體內(nèi)通過(guò)側(cè)向聚集和軸向聚集形成具有周期性超分子結(jié)構(gòu)的原纖維,這種結(jié)構(gòu)賦予了膠原蛋白韌性好、抗張力強(qiáng)等生物學(xué)特性,也一定程度上決定了膠原蛋白在生物、材料等領(lǐng)域的重要應(yīng)用價(jià)值[35]。由此可見(jiàn),草魚鱗膠原蛋白自聚集形貌更有利于其進(jìn)一步改性及利用,可用于吸附分離材料、催化劑載體及生物材料等領(lǐng)域的研究。
(a)草魚鱗膠原蛋白聚集10 h;(b)草魚鱗膠原蛋白;(c)草魚皮膠原蛋白聚集10 h;(d)草魚皮膠原蛋白圖6 草魚鱗與草魚皮膠原蛋白掃描電鏡圖(×20 000)Fig.6 Scanning electron micrographs of collagens from grass carp scale and skin(×20 000)
提取草魚鱗、草魚皮中膠原蛋白,對(duì)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行表征并比較體外自聚集行為。結(jié)果表明,魚皮、魚鱗膠原蛋白均為典型的I型膠原蛋白,但二級(jí)結(jié)構(gòu)存在一定差異。2種膠原蛋白均可產(chǎn)生體外自聚集行為且聚集程度基本一致。SEM圖像顯示魚鱗膠原蛋白形成形狀分明的纖維網(wǎng)狀聚集結(jié)構(gòu),且能觀測(cè)到膠原原纖維的周期性橫紋D帶,這種結(jié)構(gòu)將能提高膠原基材料的生物性能,有利于其進(jìn)一步改性及利用,可望應(yīng)用于吸附分離材料、催化劑載體及生物材料等領(lǐng)域。2種不同來(lái)源膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異可能對(duì)其自聚集微觀形貌有一定影響,具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。該研究結(jié)果對(duì)于解釋不同來(lái)源膠原蛋白自聚集能力行為差異具有一定理論意義。
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