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    生物芯片在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

    2018-03-27 10:09:40馬新秀胡文忠馮可司琦2
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:生物芯片微流高通量

    馬新秀,胡文忠,馮可,司琦2,

    1(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,遼寧 大連,116600) 2(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連,116600) 3(生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連,116600)

    生物芯片(biochip)是20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的一種高通量、并行分析的微量分析技術(shù)[1]。它構(gòu)建在玻璃片、硅片、塑料片、尼龍膜或凝膠等載體材料上,表面上固定了不同的生物分子(如:寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、多肽、抗原、抗體等),形成可與目的靶分子互相作用和反應(yīng)的固相表面。將芯片與待檢靶生物分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)(如雜交、免疫反應(yīng)等)[2],然后利用相應(yīng)的檢測(cè)手段進(jìn)行信號(hào)的收集,得出檢測(cè)結(jié)果[3]。

    生物芯片主要特點(diǎn)有:(1)高通量:采用原位合成法或直接點(diǎn)樣法將探針排列在濾膜、硅片、玻璃等介質(zhì)上形成微矩陣,待檢樣品用同位素或熒光分子標(biāo)記后,與芯片雜交,通過(guò)掃描及計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達(dá)信息,以達(dá)到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的;(2)高靈敏度:芯片檢測(cè)結(jié)果的敏感性為96.2%,每種病毒檢測(cè)的最低量為10 copies/μL,使生物芯片具有較的高靈敏度;(3)高特異性:芯片在雜交反應(yīng)完畢后進(jìn)行洗脫,使不與靶標(biāo)結(jié)合或非特異性結(jié)合的部分洗脫掉,芯片檢測(cè)結(jié)果的特異性為99.3%。在生物大分子功能研究、食品安全檢測(cè)、病原微生物檢測(cè)和鑒定等方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

    1 生物芯片技術(shù)的研究進(jìn)展

    生物芯片是指采用微量點(diǎn)樣或光導(dǎo)原位合成等方法,將大量核酸片段、抗原、抗體、多肽分子等生物樣品有序地固化于支持物(玻片、玻璃片、硅片等)表面,形成密集的二維分子排列形式,一般生物芯片只會(huì)采用一種類(lèi)型的探針,即用核酸或抗體作為探針,然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子雜交,通過(guò)特定的儀器如電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)(CCD)或激光共聚焦掃描儀對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析,從而判斷樣品中靶分子的種類(lèi)和數(shù)量[4]。

    生物芯片根據(jù)其構(gòu)造不同可分為陣列型芯片、微流控芯片、納米芯片等[5];根據(jù)其分析的探針不同可分為基因芯片、糖芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等[6];根據(jù)其應(yīng)用不同可分為表達(dá)譜芯片、診斷芯片、檢測(cè)芯片、基因組SNP分析芯片、基因組染色體變異分析芯片以及藥物分析芯片等。各種芯片各有特點(diǎn),但都具有高通量、高特異性和高效的共性。

    1.1 微陣列芯片

    微陣列芯片主要包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和細(xì)胞芯片等生物芯片,是將數(shù)十甚至數(shù)萬(wàn)種生物探針?lè)肿右躁嚵械男问焦潭ㄔ诶迕准?jí)別的固體載體上,利用生物分子間的相互作用,與樣品中的靶分子結(jié)合,通過(guò)熒光、同位素放射顯影、酶標(biāo)顯色及化學(xué)發(fā)光來(lái)顯示出每個(gè)位點(diǎn)的復(fù)雜信息[7-8]。WANG等[9]設(shè)計(jì)了一個(gè)微陣列芯片,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。對(duì)80個(gè)季節(jié)性流感病毒的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),其中有66個(gè)陽(yáng)性樣本,檢測(cè)的特異性和敏感性分別為95.5%和100%,認(rèn)為微陣列芯片具有快速,可靠,價(jià)格低廉的檢測(cè)方法。ALEXANDER等[10]設(shè)計(jì)了一種高度并行的微生物檢測(cè)的寡核苷酸芯片,對(duì)多種微生物在單一芯片中高通量的并行檢測(cè),結(jié)果顯示,10~30個(gè)樣本可以在24 h內(nèi)得到可靠的分析,適合于檢測(cè)大規(guī)?;虮磉_(dá)等的研究,及微生物的定性分析?;谶@種快速、高效的特點(diǎn),微陣列生物芯片在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用,包括測(cè)定基因或蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜、研究特定的基因或蛋白質(zhì)功能、研究分子間交互作用、尋找疾病的生物學(xué)標(biāo)記、微生物鑒別以及微生物族群分析等。

    1.2 微流控芯片

    微流控芯片的最大優(yōu)點(diǎn)是在微小的空間內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理、反應(yīng)或分析的過(guò)程,從而達(dá)到集成的功能[11]。在固體基片上構(gòu)建微流道、微泵、微閥、反應(yīng)器、混合器、過(guò)濾器、分離器等微小裝置,實(shí)現(xiàn)生物樣品的制備、生物化學(xué)反應(yīng)、液相色譜分析、PCR反應(yīng)、電泳檢測(cè)等操作。它的目標(biāo)是將整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的功能,包括采樣、稀釋、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等集成在微芯片上[12]。微流控芯片可以用來(lái)反應(yīng)或分析,在生物技術(shù)中是一個(gè)非常重要的技術(shù),可實(shí)現(xiàn)成為微型化實(shí)驗(yàn)室的設(shè)想,只需將待測(cè)樣品直接加入到芯片中,芯片便會(huì)自動(dòng)執(zhí)行復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)流程,同時(shí),多個(gè)樣品或者多個(gè)反應(yīng)可在同一芯片同時(shí)處理,并且可以迅速得到結(jié)果[13-14]。LIN等[15]設(shè)計(jì)了一個(gè)微流控芯片,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量和快速的分析,穩(wěn)定性較高,是一種一體化、小型化、易于自動(dòng)化的檢測(cè)分析裝置。微流控系統(tǒng)的特點(diǎn)主要表現(xiàn)在高通量、低劑量、快速分析且具有便捷性等方面,現(xiàn)已應(yīng)用于DNA分析,免疫分析和細(xì)胞分析。微流控芯片可以用于快速分析微生物的生物學(xué)特征,對(duì)微生物的檢測(cè)有著十分重要的意義。

    1.3 納米芯片

    近年來(lái),貴金屬納米粒子由于其獨(dú)特的光學(xué)特性,成為傳感器優(yōu)化傳感的關(guān)鍵元件,具有高靈敏度、高效和無(wú)標(biāo)記檢測(cè)等特性。這樣的傳感器能夠同時(shí)檢測(cè)和分析大量的樣品或單一樣品中的多個(gè)分析物。納米粒子固定在傳感器芯片表面上,通過(guò)物理屏障形成不同的區(qū)域,用于并行檢測(cè),這些孤立的檢測(cè)區(qū)域在一定程度上實(shí)現(xiàn)了高通量檢測(cè)[16]。

    通過(guò)病原體或病原體分泌的毒素與活性物質(zhì)同傳感器上的受體結(jié)合,納米粒子用于傳感器中,根據(jù)顏色變化來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。希迪安等在2007年制作了一個(gè)以玻璃支撐的聚二乙炔(PDA)為基礎(chǔ),由細(xì)菌分泌的誘導(dǎo)增殖的兩親分子在PDA基質(zhì)上引起顏色改變的比色傳感器,能夠?qū)?xì)菌進(jìn)行檢測(cè)[17]。

    新興的納米技術(shù)具有復(fù)用能力以及無(wú)酶的操作能力。納米材料具有獨(dú)特的化學(xué)和物理性能能夠適用于醫(yī)學(xué)檢測(cè),如具有良好的生物相容性,高的表面積與體積比,與散裝材料相比,具有獨(dú)特的光學(xué)特性。最近幾年,用納米金識(shí)別和結(jié)合DNA,并用電化學(xué)方法來(lái)監(jiān)測(cè)的工具逐漸增加,這種方法可以通過(guò)測(cè)定氯化物在納米探針的表面固定化的氧化還原電位的變化確定靶DNA的濃度,同時(shí),硫化鉛納米粒子被作為寡核苷酸的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行電化學(xué)的檢測(cè)。這種電化學(xué)檢測(cè)的范圍在10-11~10-12[18],可見(jiàn)納米生物芯片具有較高的檢測(cè)靈敏度。

    2 生物芯片檢測(cè)微生物

    2.1 微陣列芯片在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

    MARINA等[19]利用共聚物吸附的方法在芯片表面用聚二甲基硅氧烷涂層,通過(guò)共聚物涂層的聚二甲基硅氧烷的芯片,同共價(jià)結(jié)合氨基修飾的DNA片段結(jié)合,應(yīng)用于細(xì)菌基因分型實(shí)驗(yàn)。這種共聚涂層的聚二甲基硅氧烷的芯片可作為半自動(dòng)的DNA微陣列芯片來(lái)快速檢測(cè)食品中的病原菌。這種涂膜的芯片既因微陣列而具有高通量,可以同時(shí)檢測(cè)多種菌,又因聚二甲基硅氧烷使芯片具有最佳的特異性和靈敏度。對(duì)芯片的修涂層修飾可提高芯片的靈敏度和特異性,但探針的設(shè)計(jì)也十分重要,如SEUNG等[20]利用23 SrDNA和16 S-23 SrDNA基因間隔區(qū)(ISR)進(jìn)行探針的設(shè)計(jì),因?yàn)樵?3 SrDNA和16 S-23 SrDNAISR中既有保守區(qū)又有特異性的區(qū)域。并且利用這樣的探針,設(shè)計(jì)出了微陣列芯片,應(yīng)用于39種致病菌的檢測(cè),這種微陣列芯片檢測(cè)的檢出限在10~103CFU/mL,能夠應(yīng)用于多種致病菌的檢測(cè)。微陣列芯片檢測(cè)快速,可以對(duì)樣品中的多種菌進(jìn)行檢測(cè),如YU等[21]用微點(diǎn)樣的方法結(jié)合多重PCR設(shè)計(jì)出微陣列芯片。對(duì)五種沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè),并在雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè),將雞肉樣品打成勻漿后,利用芯片檢測(cè),檢出限可達(dá)102CFU/mL,這種生物芯片能同時(shí)對(duì)這五種沙門(mén)氏菌中的任何一種進(jìn)行定性分析。并且可以利用這種芯片來(lái)檢測(cè)家禽及家禽產(chǎn)品的沙門(mén)氏菌感染情況,而且同時(shí)適用于其他食品樣品的沙門(mén)氏菌檢測(cè)。微陣列芯片不僅加快了樣品檢測(cè)的速度,同時(shí)提高了檢測(cè)的靈敏度,MARISA等[22]將微陣列芯片應(yīng)用于純培養(yǎng)參考菌株和家禽肉樣本中彎曲桿菌的檢測(cè),得到生物芯片在檢測(cè)中的靈敏度,同標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行比對(duì),如PCR、平板計(jì)數(shù)和斑點(diǎn)雜交等。體現(xiàn)出微陣列芯片在家禽肉檢測(cè)中快速簡(jiǎn)單可靠的特性,不同濃度的彎曲桿菌純培養(yǎng)的生物芯片檢測(cè),得出的結(jié)果顯示出良好的線(xiàn)性關(guān)系,這種檢測(cè)彎曲桿菌的微陣列芯片比經(jīng)典平板法和分子法要敏感20倍,而且使用更加方便,穩(wěn)定性也更好。微陣列芯片上密集著大量的探針,可以對(duì)微生物進(jìn)行高通量的檢測(cè),大大節(jié)省了檢測(cè)的時(shí)間。但是芯片的建立繁瑣,需要技術(shù)人員的指導(dǎo),因此,芯片的簡(jiǎn)易制作和推廣成為了其今后發(fā)展的方向。

    2.2 微流控芯片在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

    ZHE等[23]設(shè)計(jì)了一個(gè)微流控芯片來(lái)檢測(cè)細(xì)菌DNA。芯片是由聚二甲基硅氧烷(PDMS)來(lái)制備的,它包括固相萃取(SPE)室,兩個(gè)獨(dú)立的通道和多回路介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)室。3株細(xì)菌(大腸桿菌O157:H7,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌)被用來(lái)測(cè)試該設(shè)備的可行性。多環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的產(chǎn)量直接由紫外光檢測(cè),并由瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)。使用這種芯片,成功地在2 h之內(nèi)檢測(cè)出了這3種菌,3種菌的檢出限小于102CFU/100μL。但該芯片還需其他的設(shè)備來(lái)證實(shí)結(jié)果,實(shí)時(shí)在線(xiàn)檢測(cè)更能縮短檢測(cè)時(shí)間,WANG等[24]將通過(guò)CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)氏菌,在一個(gè)多通道的微流控芯片系統(tǒng)中,由發(fā)光二極管進(jìn)行熒光檢測(cè),由CdSe/ZnS作為熒光標(biāo)記點(diǎn),提高了檢測(cè)的靈敏度。這種微流控芯片由12個(gè)樣品通道,3個(gè)混合區(qū)和6個(gè)免疫反應(yīng)區(qū)組成,利用免疫反應(yīng),通過(guò)熒光檢測(cè),檢出限在37 CFU/mL。這種在線(xiàn)標(biāo)記的原位熒光檢測(cè)的多通道微流控芯片已經(jīng)成功應(yīng)用于豬肉樣品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。微流控芯片可以作為一種微型實(shí)驗(yàn)室對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè),如RAFAL等[25]利用微流控芯片對(duì)多種病原菌進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)微流控芯片進(jìn)行DNA/RNA的提取,實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè),將微流控芯片設(shè)計(jì)成一個(gè)小型的可移動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室。這種芯片具應(yīng)用了新的光學(xué)檢測(cè)方法。微腔的設(shè)計(jì)以及多個(gè)微腔,滿(mǎn)足多個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè),具有高效,節(jié)省樣品,便攜等特點(diǎn),并且成功的應(yīng)用在檢測(cè)沙門(mén)氏菌,霍亂弧菌等致病菌當(dāng)中。微流控芯片不僅便攜,而且檢測(cè)的靈敏度也較高,如HSU等[26]設(shè)計(jì)的芯片應(yīng)用于生物樣品的DNA雜交實(shí)驗(yàn),應(yīng)用DNA特異性探針雜交技術(shù)檢測(cè)病原菌。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,可將已知的單鏈作為“DNA探針”,然后同其他未知DNA序列的溶液混合可通過(guò)DNA探針判斷是否存在互補(bǔ)DNA片段,利用熒光標(biāo)記的方法,在532 nm的綠光下,檢測(cè)生物樣品的存在,靈敏度要比傳統(tǒng)比色法高1 000~500 000倍,這是一種更加靈敏、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。微流控芯片具有便捷,高效,高通量等特點(diǎn),但是微流控芯片由于集成的功能,微型化的程度不如其它芯片,因此更微小的芯片可作為今后微流控芯片研究的方向。

    2.3 納米芯片在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

    BHAWANA等[27]將聚苯胺納米粒子固定在瓊脂糖凝膠上,形成一個(gè)生物芯片,用其對(duì)細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),通過(guò)明顯的顏色變化(從藍(lán)色到綠色)來(lái)顯示結(jié)果。由于沒(méi)有特定的抗體或受體的使用,這種芯片可以檢測(cè)任何細(xì)菌生長(zhǎng)??梢詰?yīng)用于食品中腐敗微生物的檢測(cè)。還可以利用銀-對(duì)苯二酚溶液來(lái)增強(qiáng)檢測(cè)效果,CHIA-HSIEN等[28]介紹了一種細(xì)菌光學(xué)生物芯片基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的DNA雜交檢測(cè)方法。將鮑曼不動(dòng)桿菌作為DNA樣本的來(lái)源,用生物素標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌DNA,以及用金-鏈霉親和素納米粒子和銀-對(duì)苯二酚溶液來(lái)增強(qiáng)檢測(cè)。由于金納米粒子利用對(duì)苯二酚催化銀制金屬的銀離子。逐漸沉淀的銀離子導(dǎo)致光學(xué)檢測(cè)信號(hào)的差異,通過(guò)肉眼或光學(xué)儀器(如平板掃描儀)很容易地觀(guān)察到。銀染的的方法應(yīng)用于納米芯片,使檢測(cè)結(jié)果更易觀(guān)察,如劉和平[29]建立了一種簡(jiǎn)單、快速的比色芯片判斷PCR產(chǎn)物存在與否的方法。用鏈霉親和素-納米金結(jié)合銀染的方法鑒定4種不同大腸桿菌血清型。結(jié)果表明,納米金比色芯片檢測(cè)結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果一致,芯片雜交的納米金標(biāo)記與熒光標(biāo)記檢測(cè)的結(jié)果相當(dāng),這個(gè)實(shí)驗(yàn)合成了7對(duì)引物,優(yōu)化了七重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,該實(shí)驗(yàn)可直接用肉眼觀(guān)察檢測(cè)結(jié)果,可以用來(lái)檢測(cè)食品中的微生物。納米芯片雖然能夠用肉眼直接觀(guān)察結(jié)果,但比較耗時(shí)費(fèi)工,成本較貴,因此降低納米芯片的成本能使納米芯片更廣泛地應(yīng)用于微生物的檢測(cè)。

    2.4 其他生物芯片在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

    酶芯片:SU等[30]提出了基于CMOS陣列光電傳感器和1×3聚合酶生物芯片對(duì)大腸埃希氏菌進(jìn)行光學(xué)一步檢測(cè)。這種方法使用4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸(MUG)作為熒光底物,對(duì)β-葡萄糖苷酸酶(GUD)的檢出限是0.1 u/mL,約等于106CFU/mL大腸桿菌的細(xì)胞濃度。MUG以最終濃度100 μL/mL混合于月桂基蛋白胨培養(yǎng)基中,能夠在1×3聚合酶生物芯片中立即檢測(cè)出大腸桿菌的存在,對(duì)40株大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè),都有較好的結(jié)果。

    糖微陣列芯片(glycochip):糖微陣列芯片是監(jiān)測(cè)碳水化合物配體和其他生物大分子的分子間相互作用的現(xiàn)代生物技術(shù)。這種芯片具有微尺度、響應(yīng)快、靈敏度高、高通量等特點(diǎn)。它廣泛應(yīng)用于許多研究和開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。如WAN等[31]提出,多糖是生物信息的重要載體,在生物體中參與許多生理過(guò)程,如能量?jī)?chǔ)備、病理變化、細(xì)胞代謝、抗原抗體結(jié)合等。細(xì)菌細(xì)胞表面具有許多多糖和糖苷化合物如莢膜多糖、脂多糖和糖蛋白。利用熒光硅納米標(biāo)記細(xì)菌,并用碳水化合物芯片對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),具有較好的檢測(cè)效果。

    可視化芯片:顧大勇等[32]研究建立了能同時(shí)檢測(cè)幾種腸道病原體(霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7)的可視化快速、高效的基因芯片檢測(cè)技術(shù)。該芯片具有較好的特異性和重復(fù)性,檢測(cè)靈敏度可達(dá)25 ng/μL,芯片檢測(cè)結(jié)果與PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致。

    生物芯片樣品制作和標(biāo)記方法復(fù)雜,造成生物芯片技術(shù)在食品檢測(cè)方面需要更高的成本和勞動(dòng)力,簡(jiǎn)化樣品制作,可減少成本,提高檢測(cè)效率。

    3 展望

    生物芯片技術(shù)在病原微生物診斷、抗藥基因、毒力基因、致病因子的檢測(cè)等方面顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿?,現(xiàn)已成為新的研究熱點(diǎn)。不但可以應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè),還可以用于生物毒素和病毒等的檢測(cè)。但是,該技術(shù)本身還存在一些缺陷和亟需改善的地方。如現(xiàn)階段的生物芯片大多還要采用熒光(Cy3和Cy5等熒光染料)標(biāo)記技術(shù)[33]。芯片檢測(cè)需要激光共聚焦掃描儀這種價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備,令使用生物芯片的成本提高。相對(duì)應(yīng)出現(xiàn)的一種可視化芯片,不需要高昂的熒光掃描設(shè)備,只需用肉眼或借用簡(jiǎn)單的設(shè)備便可觀(guān)察結(jié)果,既方便又降低了成本。近年來(lái)微電子技術(shù)已經(jīng)滲透到人們的工作、生活以及生產(chǎn)活動(dòng)中,成為現(xiàn)代化生產(chǎn)與現(xiàn)代生化的主要支柱,半導(dǎo)體技術(shù)作為微電子技術(shù)可用于制作生物芯片,能使生物芯片朝著更加微型化的方向發(fā)展[34]。制造微型全分析系統(tǒng)或微芯片實(shí)驗(yàn)室也是生物芯片未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。集成化使生物芯片使用起來(lái)更加方便,生物芯片也將在集成化的方向擴(kuò)展。

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