芍藥花提取物對果蔬腐敗菌的抑菌活性及其在櫻桃番茄保鮮中的應(yīng)用

李雯霞，于司達，諸葛斌，方慧英*，宗紅，陸信曜，孫進，馮倩

1(江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122) 3(浙江省調(diào)味食品制造工程技術(shù)研究中心，浙江 義烏，322000)

芍藥(Paeonialactiflora,P.lactiflora)，為草本花卉，其根入藥，味苦、微寒、歸肝經(jīng)，為中國傳統(tǒng)中藥，另外，芍藥花還可以作為膳食、制茶、提取香精等，具有一定的保健和醫(yī)療功效[1]。前人的研究表明，芍藥花具有很強的抗氧化活性，這可能與沒食子酸甲酯、紫云英苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷等活性成分有關(guān)[2-3]；芍藥花的多種萃取物和提取物均具有很強的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力[4-5]。然而目前關(guān)于芍藥花提取物的研究主要集中在其抗氧化活性及成分分析上[6-7]，對其天然物質(zhì)成分的抑菌活性尚未見報道。本項目旨在研究芍藥花提取物對果蔬腐敗菌的抑菌性能，并以櫻桃番茄為例研究芍藥花提取物在其貯藏過程中的保鮮效果，為開發(fā)天然高效的植物源防腐劑提供理論依據(jù)及借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芍藥花，采自無錫市濱湖區(qū)，將花蕾期的芍藥花除去塵土、腐敗物、花托等雜質(zhì)，65 ℃烘箱內(nèi)迅速烘干后粉碎，過40目篩，放于干燥器內(nèi)備用。櫻桃番茄采自無錫市蔬菜種植基地，八成熟。

供試菌株：枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、灰色葡萄孢霉(Botrytiscinerea)、季也蒙畢赤酵母(Meyerozymacaribbica)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)是由本實驗室從果蔬中篩選獲得的優(yōu)勢腐敗菌。

95%乙醇、蒽酮等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

GNP-9080型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；BK-FL4型熒光顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；FreeZone 4.5L型冷凍干燥機，美國Labconco公司；R220E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦工業(yè)有限公司；CR22G型冷凍離心機，日立公司；LR35B便攜式折光率儀，梅特勒-托利多儀器有限公司；CHK-122型電導(dǎo)率儀，北京昌科儀自動化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芍藥花提取物樣品的制備

采用乙醇提取法，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%、溫度為70～80 ℃、料液比1∶10的條件下回流提取2 h，重復(fù)2次，浸提液經(jīng)抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥制成凍干粉，4 ℃冰箱密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑菌圈、最低抑制質(zhì)量濃度的測定

濾紙片擴散法：用芍藥花提取物(100 mg/mL)將濾紙片(直徑6 mm)蘸濕，置于已均勻涂布供試菌(濃度為106CFU/mL)的培養(yǎng)基上，以浸泡無菌生理鹽水的濾紙片作對照。細菌37 ℃培養(yǎng)24 h，霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，酵母30 ℃培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑，每組做3個平行。同樣采用濾紙片擴散法測定芍藥花提取物對供試菌的最低抑制質(zhì)量濃度，以出現(xiàn)抑菌圈的臨界濃度作為最低抑制質(zhì)量濃度，每組做3個平行。

1.3.3 最低致死質(zhì)量濃度的測定

培養(yǎng)菌體至對數(shù)生長期(濃度為106CFU/mL)，接種至含不同質(zhì)量濃度提取物的液體培養(yǎng)基中，細菌37 ℃培養(yǎng)24 h，霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，酵母30 ℃培養(yǎng)48 h，之后分別取菌液接種至固體培養(yǎng)基上，菌體不生長的濃度即為最低致死質(zhì)量濃度，每組做3個平行。

1.3.4 芍藥花提取物對菌體生長的影響

將枯草芽孢桿菌(濃度為106CFU/mL)接種到含不同濃度芍藥花提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2 h測定菌液OD值，每組做3個平行。

1.3.5 芍藥花提取物對菌懸液電導(dǎo)率的影響

在枯草芽孢桿菌(濃度為106CFU/mL)菌液中加入芍藥花提取物，使其終質(zhì)量濃度為2、4 mg/mL，分別在0、1、5、10、15、20、25 min時，用電導(dǎo)率儀測定菌液的電導(dǎo)率，以未加芍藥花提取物處理的菌液為對照，每個樣品重復(fù)3次。

1.3.6 芍藥花提取物對菌懸液內(nèi)容物質(zhì)的影響

根據(jù)LV等[8]的方法，將菌體用不同質(zhì)量濃度的芍藥花提取物重懸，分別在0、2、4、6、8 h時，離心，取上清液測定OD260值、OD280值及可溶性糖含量，每個樣品重復(fù)3次；可溶性糖含量測定參照曾榮[9]的方法，以未經(jīng)芍藥花提取物處理組為對照。

1.3.7 櫻桃番茄的保鮮處理方法

挑選果形端正、顏色大小均勻、無病蟲斑和機械損傷的櫻桃番茄，用芍藥花提取物(10 mg/mL)浸泡3 min，取出自然晾干，用保鮮膜密封，每份600 g，每個處理3份，以無菌生理鹽水浸泡為對照。將處理好的櫻桃番茄置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中貯藏，每隔3 d進行檢測。

1.3.8 櫻桃番茄測定指標(biāo)及方法

(1)腐爛率/%=腐爛個數(shù)/總個數(shù)×100；

(2)失重率/%=果實質(zhì)量差/果實質(zhì)量×100；

(3)Vc含量：檢測方法參照文獻[10]，每個處理重復(fù)3次；

(4)可溶性固形物：采用手持折光儀測定，每個處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行制圖并使用SPSS 11.5對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥花提取物對果蔬腐敗菌的抑菌活性

芍藥花提取物(100 mg/mL)對各腐敗菌的抑菌效果如表1所示。

芍藥花提取物對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及酵母均有較強的抑制作用，而對霉菌無抑制作用，其中對細菌的抑制效果最好，這可能是因為細菌細胞壁較薄，主要成分是肽聚糖，容易被分解，而酵母細胞壁較厚，主要成分是幾丁質(zhì)，較穩(wěn)定，對細胞結(jié)構(gòu)具有一定的保護作用[11-12]。

2.2 芍藥花提取物對菌體生長的影響

以枯草芽孢桿菌為例研究芍藥花提取物對菌體生長的影響，結(jié)果如圖1所示，在培養(yǎng)基中添加2 mg/mL(1 MIC)芍藥花提取物后，枯草芽孢桿菌的生長受到顯著抑制，其生長相較于對照組具有較長的延滯期，且最終生物量僅為對照組的34%；而添加了4 mg/mL(2 MIC)提取物后，菌體則完全不能生長。由此表明，芍藥花提取物對枯草芽孢桿菌的生長具有較強的抑制作用。

表1 芍藥花提取物對腐敗菌的抑菌圈大小、最低抑制濃度及致死濃度Table 1 The inhibitory circle size、minimum inhibitoryand bactericidal concentration of the P. lactiflora flowerextracts on spoilages

注：“-”表示無抑制作用。

圖1 不同濃度的芍藥花提取物下枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of B.subtilis under different concentrations of P.lactiflora flower extracts

2.3 芍藥花提取物對菌體細胞膜的影響

2.3.1 對菌液電導(dǎo)率的影響

細胞膜是菌體的保護屏障，當(dāng)細胞膜遭到破壞時，其內(nèi)部的電解質(zhì)外泄至溶液中，從而使電導(dǎo)率上升，因此菌液電導(dǎo)率的變化可以反映細胞膜通透性的變化[12]。不同質(zhì)量濃度提取物對菌液電導(dǎo)率的影響如圖2所示。

圖2 不同濃度的芍藥花提取物下枯草芽孢桿菌菌液電導(dǎo)率的變化Fig.2 Changes of the electrical conductivity of B.subtilis under different concentrations of P.lactiflora flower extracts

枯草芽孢桿菌經(jīng)2、4 mg/mL芍藥花提取物處理后，菌液電導(dǎo)率在1 min內(nèi)瞬間迅速升高，且提取物濃度越高電導(dǎo)率值越大。有研究報道聚賴氨酸處理枯草芽孢桿菌菌體1 h后電導(dǎo)率上升[13]，五味子木質(zhì)素處理大腸桿菌菌體5 min后電導(dǎo)率發(fā)生明顯變化[14]，與二者相比，芍藥花提取物處理菌體后電導(dǎo)率迅速上升，表明其對菌體細胞膜的破壞能力更強，更加高效。

2.3.2 對內(nèi)容物質(zhì)的影響

核酸、蛋白質(zhì)類、可溶性糖貫穿于整個胞膜和胞質(zhì)當(dāng)中[15-16]，而釋放則表明其細胞膜結(jié)構(gòu)遭到了破壞。對經(jīng)芍藥花提取物處理后的枯草芽孢桿菌菌體核酸、蛋白質(zhì)、可溶性糖等內(nèi)容物進行測定，如圖3所示。經(jīng)提取物處理后，枯草芽孢桿菌上清液中的OD260值、OD280值，可溶性糖均隨時間的變化而逐漸增大，且芍藥花提取物濃度越高，其相對值越大。因此經(jīng)芍藥花提取物處理后，細胞膜結(jié)構(gòu)可能遭到了破壞，從而導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)、可溶性糖滲出。表明芍藥花提取物可能是通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，使胞內(nèi)功能性物質(zhì)大量滲出，自身代謝紊亂從而達到抑菌的目的。

圖3 芍藥花提取物對枯草芽孢桿菌菌體OD260、OD280(A)和可溶性糖(B)影響Fig.3 Effect of P.lactiflora flower extracts on the OD260，OD280(A)and soluble sugar(B)of B.subtilis

2.4 芍藥花提取物對櫻桃番茄的保鮮效果

2.4.1 對櫻桃番茄腐敗率和失重率的影響

果實腐爛率和失重率是判斷保鮮效果的主要表觀指標(biāo)。經(jīng)提取物(10 mg/mL)處理后，櫻桃番茄腐爛率和失重率變化見圖4。隨著貯藏時間的延長，未經(jīng)處理的櫻桃番茄腐敗率和失重率逐漸增加，在第12天腐敗率和失重率已分別達到20%、12.5%；而芍藥花提取物處理組，第12天仍未腐爛，失重率僅5.5%，與對照組相比失重率減少7%。胡曉亮等[17]分別用1%的殼聚糖和海藻酸鈉處理櫻桃番茄果實，在4 ℃下貯藏時第3天已開始腐敗，第12天腐敗指數(shù)已達到0.1，失重率為6%左右；張鵬[18]等研究表明，在氣調(diào)保鮮下，用1.2 g/L的納他霉素處理櫻桃番茄，第10天時，壞果率已達到6%，與之相比，芍藥花提取物能更有效抑制櫻桃番茄的腐敗。

圖4 芍藥花提取物對櫻桃番茄腐敗率(A)、失重率(B)的影響Fig.4 Effect of P.lactiflora flower extracts on rot rate (A) and weight loss rate (B) of cherry tomatoes

2.4.2 對櫻桃番茄品質(zhì)的影響

可溶性固形物含量的高低，在一定程度上反映了貯藏過程中果實營養(yǎng)物質(zhì)保留的多少，Vc是櫻桃番茄果實中最重要的營養(yǎng)成分之一，作為還原型物質(zhì)在櫻桃番茄貯藏過程中極易氧化損失，因此可溶性固形物、Vc含量是檢測果實品質(zhì)的重要指標(biāo)[19]。從圖5中可以看出，在櫻桃番茄的整個貯藏期間，可溶性固形物含量呈現(xiàn)出先略有上升，然后緩慢下降的趨勢，且變化幅度較小，這種先上升后下降的趨勢，與劉曉茜的研究相一致[20]，可能是由于貯藏早期高分子碳水化合物水解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，而隨后可溶性糖由于呼吸作用被不斷消耗所致，經(jīng)芍藥花提取物處理過后的果實可溶性固形物含量降低速率明顯緩于空白組；貯藏期間Vc含量同樣呈下降趨勢，但與對照相比，芍藥花提取物處理的Vc含量下降緩慢，在第12天時Vc含量仍可達到14.3 mg/100 g，提取物對Vc的保護作用可能是由于芍藥花提取物中含有豐富的抗氧化物質(zhì)[6-7]。因此，芍藥花提取物可減緩櫻桃番茄可溶性固形物及Vc的損失，從而減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失。

圖5 芍藥花提取物對櫻桃番茄可溶性固形物含量(A)、Vc含量(B)的影響Fig.5 Effect of P.lactiflora flower extracts on the content of soluble solids(A)and Vc(B)in cherry tomatoes

3 結(jié)論

本研究以芍藥花提取物為研究對象，對其抑菌活性、最低抑制濃度、最低致死濃度及抑菌方式進行了初步探討，并通過測定貯藏過程中櫻桃番茄的腐敗率、失重率、可溶性固形物及Vc含量考察其在果蔬貯藏中的保鮮效果。研究表明，芍藥花提取物對細菌、酵母具有較強的抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌最低抑制質(zhì)量濃度和致死質(zhì)量濃度分別為2 mg/mL和4 mg/mL。芍藥花提取物通過增加細胞膜通透性，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)的方式而達到抑菌目的；利用芍藥花提取物處理櫻桃番茄能夠降低番茄腐敗率、失重率，延緩可溶性固形物以及Vc的降解速率，減少營養(yǎng)物質(zhì)流失，保鮮效果良好，是一種具有應(yīng)用前景的優(yōu)良保鮮劑。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 舒希凱,段文娟,劉偉,等.芍藥花化學(xué)成分研究[J].中藥材,2014,37(1):66-69.

[3] 陳曼麗.芍藥花抗氧化和抗炎活性成分的提取與分離[D].揚州:揚州大學(xué),2014.

[4] JIN Y S,XUAN Y H,JIN Y Z,et al.Biologicalactivities of Herbaceous peony flower extracts[J].Asian Journal of Chemistry,2013, 25(8):3 835-3 838.

[5] 馬英,田麗萍,高婷婷,等.新疆芍藥與窄葉芍藥根中多糖含量測定及體外抗氧化活性的研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2014,32(5):573-577.

[6] 胡喜蘭,尹福軍,程青芳,等.不同花期芍藥花中活性成分的研究[J].食品科學(xué),2008,29(9):511-514.

[7] 石鈺.美麗芍藥化學(xué)成分及其生物活性研究[D].西安:陜西科技大學(xué),2015.

[8] LV Fei,HAO Liang,YUAN Qipeng,et al.Invitroantimicrobial effects and mechanism of action of selected plant essential oil combinations against four food-related microorganisms[J].Food Research International,2011,44(9):3 057-3 064.

[9] 曾榮.鳳仙透骨草抑菌活性成分、抑菌機理及對柑橘防腐保鮮效果的研究[D].南昌:南昌大學(xué),2012.

[10] 徐美玲.2,4-二硝基苯肼法對三種蔬菜維生素C含量的測定[J].菏澤學(xué)院學(xué)報,2015,37(2):52-55.

[11] 王鏡巖.生物化學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2002.

[12] 楊蘇聲,周俊初.微生物生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2005.

[13] 劉蔚,周濤.ε-聚賴氨酸抑菌機理研究[J].食品科學(xué),2009,30(9):15-20.

[14] 馮亞凈,張媛媛,王瑞鑫,等.五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機理及效果[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(2):72-76.

[15] STODDART A,HERTZ M I,DAVIDM,et al.Determination of antibacterial mode of action of allium sativumessential oil against foodborne pathogens using membrane permeability and surface characteristic parameters[J].Journal of Food Safety,2013, 33(2):197-208.

[16] CAROLINA P, OLLERESA, ROSA J, et al.Natamycin efficiency for controlling yeast growth in models systems and on cheese surfaces[J].Food Control,2014,35(1):101-108.

[17] 胡曉亮,周國燕.四種天然保鮮劑對櫻桃番茄貯藏的保鮮效果[J].食品科學(xué),2012,33(10):287-292.

[18] 張鵬,王劍功,李江闊,等.納他霉素在氣調(diào)保鮮櫻桃番茄中的應(yīng)用[J].食品工業(yè),2017,38(4):216-221.

[19] AYALAZAVALA J F,OMSOLIU G,ODRIOZOLASERRANOI,et al.Bio-preservation of fresh-cut tomatoes using natural antimicrobials[J].European Food Research & Technology,2008,226(5):1 047-1 055.

[20] 劉曉茜.嗜酸乳桿菌NX2-6培養(yǎng)基優(yōu)化及在櫻桃番茄保鮮中的應(yīng)用[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.