麥芽搭配及淀粉酶系活力對麥汁糖組分的影響

韓智立，胡淑敏，劉佳，董建軍，余俊紅，尹花，黃淑霞，賈士儒*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東 青島，266000) 3(青島啤酒股份有限公司，山東 青島，266000)

大麥是啤酒釀造的主要原料，通過制麥產(chǎn)生各種水解酶(淀粉酶、蛋白酶等)，糖化過程中將麥芽中的大分子物質(zhì)逐步水解為酵母可以吸收利用的營養(yǎng)成分，因此麥芽品質(zhì)對啤酒的風味、口感和營養(yǎng)等方面的影響較大[1]。大麥中淀粉含量占其干重的58%～65%，故淀粉水解是釀造過程中最重要的生化反應(yīng)之一，其糖化產(chǎn)物麥汁中的糖組成(單糖、二糖、三糖等可發(fā)酵性糖)直接影響酵母的吸收、代謝以及成品啤酒的風味和口感[2]。例如，發(fā)酵性糖(單糖、二糖及三糖)是麥汁中糖的主要成分，酵母會按照一定的順序進行吸收利用，因此其濃度和比例會影響酵母對麥汁的發(fā)酵速率和程度，進而影響到啤酒的口味[3]。此外，麥汁中存在一定比例的四糖及以上的不可發(fā)酵性糖，文獻表明其濃度及分子量分布會影響啤酒的口感[4-5]。因此，穩(wěn)定的麥汁糖組成是保證酵母發(fā)酵以及成品酒風味一致性的關(guān)鍵。

麥芽中含有3種重要的淀粉水解酶:α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶。α-淀粉酶從內(nèi)部水解淀粉α-(1,4)-糖苷鍵，將淀粉降解為麥芽糖、麥芽三糖和低聚寡糖(糊精)；β-淀粉酶從淀粉的非還原端水解α-(1,4)-糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖和糊精。極限糊精酶是麥芽中唯一的脫支酶，具有高度的特異性，專門從內(nèi)部水解淀粉的α-(1,6)-糖苷鍵，作用的產(chǎn)物是直鏈淀粉，這些產(chǎn)物可以被α-淀粉酶及β-淀粉酶進一步水解。糖化過程中，3種淀粉酶發(fā)揮協(xié)同作用，逐步將淀粉水解為麥汁中的單糖、二糖、三糖及四糖及以上糖，因此3種淀粉酶的活力及比例會影響麥汁中各種糖的濃度和比例，從而影響麥汁組分的一致性[6]。

大麥質(zhì)量容易受生產(chǎn)年份、種植區(qū)域、氣候、品種的影響而產(chǎn)生波動，直接影響酵母的生理狀態(tài)、發(fā)酵過程的釀造性能，乃至影響產(chǎn)品的口感和風味一致性，且原料品種、質(zhì)量也影響原料利用率，決定著釀造過程的經(jīng)濟性。無論在麥芽品種內(nèi)還是品種間，不同淀粉酶系的活力差異很大，導致麥汁的浸出率、糖組分及發(fā)酵度等存在較大波動，最終影響產(chǎn)品的一致性。目前國外對不同品種麥芽淀粉酶系活力差異，以及全麥釀造時淀粉酶系活力與麥汁發(fā)酵度的關(guān)系已有報道[7]。但針對國內(nèi)含輔料(大米)的釀造工藝，麥芽淀粉酶活力與麥汁極限發(fā)酵度，尤其是與麥汁糖組成的關(guān)系尚不清楚。因此闡明麥芽淀粉酶系活力及搭配對麥汁糖組成的關(guān)系，可為原料配方、糖化工藝調(diào)整、酶制劑添加提供理論指導，最終保證麥汁糖譜組成以及啤酒風味一致性。

本實驗首先分析了國內(nèi)大生產(chǎn)中普遍應(yīng)用的7種麥芽(Metcalfe、Copeland、 Hind marsh、Bass、Baudin、Scope、Gairdner)共26個麥芽樣品的淀粉酶活力，相關(guān)性分析確定了麥芽淀粉系活力與常規(guī)指標的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，模擬大生產(chǎn)含輔料(大米)釀造糖化工藝，研究配方麥芽淀粉酶系活力與麥汁極限發(fā)酵度、糖組成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥芽，加拿大麥芽 Metcalfe、Copeland，澳大利亞麥芽 Hindmarsh、Bass、Baudin、Scope、Gairdner；酒花，青島大花；釀酒酵母、大米、馬來酸(Maleic acid，sigma M0375；100 mmol/L);DTT;蘋果酸(Malic acid，sigma M0875);NaCl、NaOH;EDTA;Na3PO4·12H2O; 牛血清白蛋白；a-淀粉酶、β-淀粉酶及極限糊精酶專一性底物,愛爾蘭Megazyme公司。

Anto Parr, Austria ；高速離心機,美國Sigma 公司；EBC粉碎儀,德國Buhler公司；LB-8糖化儀,德國Lochner公司；高效液相色譜儀,美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥芽常規(guī)指標的測定

麥芽的總氮、可溶性氮、庫爾巴哈值、浸出率和糖化力的測定參照QB/T 1686—2008。

1.2.2 麥芽淀粉酶活力測定

α-淀粉酶活力：1個酶活力單位定義為，在規(guī)定的實驗條件下，過量耐高溫α-葡萄糖苷酶存在時，每分鐘從BPNPG7產(chǎn)生1微摩爾硝基苯酚所需要的α-淀粉酶的數(shù)量，被稱為1個酶活單位。

β-淀粉酶活力：1個酶活力單位定義為，在規(guī)定的實驗條件下，過量的耐熱β-葡萄糖苷酶存在時，每分鐘由G3-β-PNP產(chǎn)生1微摩爾PNP所需要的β-淀粉酶的數(shù)量，被稱為1個酶活單位。

極限糊精酶活力：一個酶活力單位被定義為，在實驗條件下，每分鐘由普魯蘭多聚糖釋放1微摩爾葡萄糖所需的極限糊精酶量。

按文獻報道，采用Megazyme公司建立的專一性的顯色底物Cerelpha, Betamy1-5, 及Limit DextriZyme測定α-淀粉酶、β-淀粉酶及極限糊精酶活性[8]。

α-淀粉酶活力測定：向裝有300 mg麥芽粉的離心管中加入5 mL淀粉提取緩沖液，混勻，20 ℃振蕩提取16 h。提取結(jié)束后12 000 r/min離心15 min，留上清淀粉酶提取液備用。將淀粉酶提取液稀釋250倍，取50 μL提取液加入2 mL離心管，40 ℃溫浴2 min，加入50 μLα-淀粉酶底物，40 ℃反應(yīng)10 min，后加入750 μL α-淀粉酶終止液，混勻后測定405 nm處的吸光值。

β-淀粉酶活力測定，提取過程同α-淀粉酶的提取，將淀粉酶提取液稀釋25倍，取50 μL提取液加入2 mL離心管，40 ℃溫浴2 min，加入50 μLβ-淀粉酶底物，40 ℃反應(yīng)10 min，后加入750 μLβ-淀粉酶終止液，混勻后測定405 nm處的吸光值。

極限糊精酶活力測定：向裝有300 mg麥芽粉的離心管中加入5 mL加入DTT的淀粉提取緩沖液，混勻，20 ℃振蕩提取16 h。提取結(jié)束后12 000 r/min離心15 min，留上清淀粉酶提取液備用。取11.5 mg的Azurine-crosslinked-pullulan專一性底物于平底管中，40 ℃溫浴2 min，后加入100 μL極限糊精酶提取液，40 ℃準確反應(yīng)10 min，加入1 mL極限糊精酶終止液，12 000 r/min離心40 min，測定上清在595 nm處的吸光值。

1.2.3 麥汁的制備

1.2.3.1 協(xié)定法麥汁制備工藝

準確稱取50.0 g麥芽粉樣品于已知重量的糖化杯中，加入45 ℃的水200 mL，在不斷攪拌下于45 ℃水浴中保溫30 min。使醪液以1 ℃/min的速度，升溫加熱水浴，在25 min內(nèi)升至70 ℃，此時于杯內(nèi)加入70 ℃的水100 mL，使醪液于70 ℃下保溫1 h后,在10～15 min內(nèi)迅速冷卻至室溫。用水沖洗攪拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其內(nèi)容物準確稱量為450.0 g。用玻璃棒攪動糖化醪，并用中速濾紙過濾，將最初收集的約100 mL濾液返回重濾，收集濾液于干燥燒杯中。

1.2.3.2 大生產(chǎn)麥汁制備工藝

采用的工藝路線如圖1。

圖1 糖化工藝曲線Fig.1 Mashing craft curve

糊化:取粳米粉30.0 g于糊化杯，依次加入100 mL蒸餾水、10 μL耐高溫淀粉酶。糖化：取70.0 g麥芽粉，依次加入280 mL蒸餾水、18.6 μL乳酸。糖化醪液用單層中速濾紙過濾，并加入150 mL于73 ℃保溫的蒸餾水進行洗糟。在濾后的麥汁中加入0.320 g酒花、25 μL乳酸，煮沸60 min，煮沸結(jié)束后待冷卻至室溫，用雙層中速濾紙過濾，濾后的麥汁調(diào)糖度為13.0 °P，得到的麥汁用于下一步分析。

實驗中采用加麥與澳麥按照1∶1的比例搭配使用，并按照大生產(chǎn)麥汁制備工藝制備麥汁。

1.2.4 麥汁極限發(fā)酵度的測定

量取100 mL麥汁樣品隔水煮沸10 min，后轉(zhuǎn)移至500 mL三角瓶，加入20.0 g用濾紙吸干水分的酵母餅，塞好棉塞，置于搖床，18 ℃，150 r/min，振蕩16 h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液用雙層中速濾紙過濾，濾得的發(fā)酵液用Anto Parr測定其極限發(fā)酵度。

1.2.5 麥汁糖組分的測定

按照文獻報道采用體積排阻色譜結(jié)合離子交換模式分離并定量檢測麥汁中的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖及麥芽四糖及以上糖(糊精)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種麥芽淀粉酶活性差異分析

通過分析7個麥芽品種共26個麥芽的淀粉酶系活力發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活力范圍分別為151～335 U/g，455～1 121 U/g和245～468 mU/g(表1)。β-淀粉酶活力最高，α-淀粉酶次之，極限糊精酶活性最低，僅為α-淀粉的千分之一；進一步利用方差顯著性分析發(fā)現(xiàn)，不同麥芽品種間α-淀粉酶(p<0.01)、β-淀粉酶(p<0.01)和極限糊精酶(p<0.01)活性水平差異都極顯著(表2)。

表1 麥芽淀粉酶系活力Table 1 Amylase activity of malt

表2 不同品種麥芽的α-淀粉酶、β-淀粉酶和極限糊精酶活性差異的顯著性分析Table 2 Significance analysis of α-amylase, β-amylase and limit dextrinase in different malt varieties

注： “*”為顯著(p<0.05); “**”為極顯著(p<0.01)，下表同。

從圖2可以看出，Metcalfe及Bass的α-淀粉酶活力較高，而Copeland、Gairdner及Hindmarsh活力較低；Baudin的β-淀粉酶明顯高于其他品種；Metcalfe與Hindmarsh的極限糊精酶顯著高于其他品種，因此不同麥芽之間不僅淀粉酶活力不同，其3種淀粉酶的比例也存在較大差異，這種差異勢必會帶來麥汁糖組成的波動。此外，同一品種內(nèi)麥芽淀粉酶系活力差異較大，尤其是Gairdner麥芽，這也表明，淀粉酶活力除了受品種影響外，與產(chǎn)地、年份以及制麥工藝有關(guān)。

圖2 不同品種麥芽淀粉酶活力的箱線圖Fig.2 Boxplots of amylase activity in different varieties malt

2.2 麥芽淀粉酶系活力與常規(guī)指標的關(guān)系

選取實際生產(chǎn)中最常使用的6個麥芽，分析加麥Copeland、Metcalfe、澳麥Bass、Hindmarsh、Gairdner、Scope 6個品種麥芽常規(guī)指標及淀粉酶系活力。表3所示，加麥的浸出率普遍低于澳麥、蛋白質(zhì)含量高于澳麥，這與前期研究中蛋白質(zhì)含量與浸出率呈負相關(guān)結(jié)論一致[10]。

目前普遍采用糖化力評價麥芽淀粉水解能力，除Bass之外，加麥糖化力均高于澳麥。此外，糖化力接近的加麥Metcalfe(339)與Copeland(331)，Metcalfe淀粉酶系活力顯著高于Copeland。糖化力接近的加麥Metcalfe和澳麥Bass，雖然β-淀粉酶活力一致，但α-淀粉酶和極限糊精酶比例差異顯著。因此與糖化力相比較，淀粉酶系活力評價淀粉水解能力更為精細。相關(guān)性分析(表4)表明糖化力與極限糊精酶(r=0.932，p<0.01)、β-淀粉酶(r=0.926，p<0.01)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這與前期報道一致[11]。

表4所示，α-氨基氮與糖化力(r=0.905，p<0.05)、極限糊精酶(r=0.913，p<0.05)、α-淀粉酶(r=0.813，p<0.05)和β-淀粉酶(r=0.870，p<0.05)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。α-氨基氮反映麥芽中蛋白水解成氨基酸的能力，也間接地反映了麥芽蛋白酶活性水平。糖化力及淀粉酶反映麥芽淀粉的水解能力，表明淀粉水解與蛋白水解存在一定相關(guān)性。

表3 實驗所用麥芽常規(guī)指標與酶活力的分析Table 3 The malt index and amylase activity of malt used in experiment

表4 麥芽常規(guī)指標與淀粉酶活力的相關(guān)分析Table 4 The correlationship between malt index and amylase activity

2.3 麥芽指標與協(xié)定法制備麥汁中糖組成相關(guān)性分析

按照協(xié)定法制備麥汁，相關(guān)性分析麥汁糖組成與麥芽指標之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)(表5)，麥芽蛋白含量與不可發(fā)酵性糖含量(r=-0.964，p<0.01)之間存在極顯著的負相關(guān)性，這是由于高蛋白質(zhì)的麥芽其浸出率低，因此水解產(chǎn)生的不可發(fā)酵性糖較少。不可發(fā)酵性糖含量與極限糊精酶(r=-0.855，p<0.05)存在顯著的負相關(guān)關(guān)系，而與其他兩種淀粉酶無顯著相關(guān)。這與麥芽70%淀粉為支鏈淀粉，且極限糊精酶是唯一水解支鏈的脫支酶有關(guān)。麥芽三糖與麥芽糖化力(r=0.891，p<0.05)、β-淀粉酶(r=0.837，p<0.05)存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

表5 麥芽指標與協(xié)定麥汁中糖組分的相關(guān)性分析Table 5 The correlationship between malt index andsugar composition

2.4 搭配對麥芽淀粉酶活的影響

實際大生產(chǎn)中為了配方的穩(wěn)定和麥汁組分的一致性，不同麥芽搭配使用，為了研究搭配對配方麥芽淀粉酶系活力的影響，按照不同比例(0∶100、25∶75，50∶50，75∶25，100∶0)將Metcalfe和Gairnder進行搭配，測定配方麥芽的淀粉酶系活力，通過比較實際值和按照比例的理論計算，確定搭配對淀粉酶系活力的影響。從圖3所示，搭配后麥芽淀粉酶系活力均高于理論值，表明麥芽之間具有協(xié)同效應(yīng)。文獻表明，麥芽中存在淀粉酶類的抑制因子，可被蛋白酶水解從而釋放有活性的淀粉酶，因此搭配后高酶活麥芽中的蛋白酶活性可促進低酶活麥芽中有活性的淀粉酶的釋放，從而提高了配方麥芽淀粉酶系活力。也有文獻報道，糖化過程中外添加蛋白酶可有效提高糖化過程中淀粉酶的活力[12]。因此實際生產(chǎn)中，低酶活麥芽可通過搭配高酶活力麥芽提高自身的淀粉水解能力。

圖3 麥芽搭配使用后酶活力理論計算值與實際檢測值的關(guān)系Fig.3 The relationship between calculation and actual value in blending malt注: 預(yù)測值=麥芽a單獨使用時的測定值× 搭配時所占比例+麥芽b單獨使用時的測定值×搭配時所占比例， 加麥Metcalfe 和澳麥Hindmarsh搭配.

2.5 配方麥芽淀粉酶系活力與麥汁糖譜的關(guān)系

與國外全麥釀造工藝不同，國內(nèi)啤酒大多是輔料比較高的配方工藝。為研究含輔料釀造工藝下配方麥芽淀粉酶活對麥汁糖組成的影響，將加麥Metcalfe、Copeland分別與Bass、Scope、Hindmarsh按照不同比例(0∶100、25∶75，50∶50，75∶25，100∶0)搭配，模擬大生產(chǎn)糖化工藝，按照輔料比30%進行麥汁制備，分析麥汁極限發(fā)酵度及麥汁糖組成。

極限發(fā)酵度反映麥汁的可發(fā)酵能力，是麥汁的重要質(zhì)量指標之一。如表6所示，極限發(fā)酵度與麥汁的可發(fā)酵性糖含量(r=0.870，p<0.01)存在極顯著的正相關(guān)。極限發(fā)酵度高，麥汁可發(fā)酵性產(chǎn)物多，不可發(fā)酵性糖少，導致啤酒存在寡淡感。極限發(fā)酵度過低，會導致麥汁營養(yǎng)不足，降低酵母發(fā)酵性能。

表6 配方麥芽指標與輔料比例的麥汁組分的相關(guān)性分析Table 6 The correlationship between the index and wort sugar composition in blending malt

相關(guān)性分析表明(表6)，極限糊精酶與麥汁的極限發(fā)酵度(r=0.594，p<0.01)、麥芽糖(r=0.664，p<0.01)、可發(fā)酵性糖(r=0.630，p<0.01)之間存在極顯著的相關(guān)關(guān)系，與不可發(fā)酵性糖(r=-0.630，p<0.01)存在顯著負相關(guān)，表明極限糊精酶是麥芽淀粉水解的限速酶，極限糊精酶活力越高，麥汁中不可發(fā)酵性糖比例越低。因此，可通過測定麥芽極限糊精酶活力預(yù)測麥汁的極限發(fā)酵度與麥汁糖組成，保證麥汁組分的一致性。

圖4 極限糊精酶活力與麥汁不可發(fā)酵糖比例關(guān)系圖Fig.4 The relationship between limit dextrinase activity and the ratio of unfermentable sugars

由表7、表8和回歸分析可知，方程的一次項具有顯著性, 得到響應(yīng)值與實驗因子之間是線性關(guān)系符合一次模型：不可發(fā)酵糖比例=15.1-7.55 極限糊精酶酶活+0.014 4α-淀粉酶+0.075 4 浸出物- 0.345加麥比例。分析根據(jù)所得模型的擬合值與實驗值的關(guān)系得到圖5，從圖5可以看出，得到的線性關(guān)系與實驗結(jié)果擬合較好。因此可以根據(jù)該線性模型對麥汁中不可發(fā)酵性糖的比例進行大致估測。由模型可以看出，麥汁的不可發(fā)酵性糖的比例和麥芽浸出率、配方麥芽加麥比例、澳麥比例、α-淀粉酶活力及極限糊精酶活力相關(guān)，麥汁中不可發(fā)酵性糖和極限糊精酶活力是負相關(guān)，這是因為極限糊精酶是一種去分支酶，它可以將α-淀粉酶和β-淀粉酶作用后的支鏈糊精進一步分解，從而有效減少麥汁中不可發(fā)酵性糖的量。另外，不可發(fā)酵性糖比例和配方麥芽中加麥使用比例呈負相關(guān)，這可能是由于加麥本身淀粉酶活力普遍要高于澳麥的淀粉酶活力，因此加麥比例增加有助于麥芽淀粉的水解，將大分子糖降解為小分子的可發(fā)酵性糖。

表7 回歸系數(shù)的估計和T檢驗Table 7 Estimation of regression coefficients and T test

表8 回歸方程的各項方差分析及F值檢驗Table 8 Variance analysis of regression equation and F test

圖5 麥汁中不可發(fā)酵性糖比例實驗值與擬合值Fig.5 Experimental value and fitted value about the ratio of unfermentable sugars in wort

在實際生產(chǎn)中，利用該線性模型可以根據(jù)麥芽的相關(guān)指標，對應(yīng)調(diào)整糖化工藝，從而可以得到含有固定比例不可發(fā)酵性糖的麥汁。從而對于原料麥芽和大麥質(zhì)量的波動，改變制麥工藝或糖化工藝從而保證麥汁和啤酒在組成和口感上的一致性，保證了產(chǎn)品的品質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

糖是麥汁中最主要的成分，各種糖的濃度及比例會影響酵母的吸收代謝及成品酒的啤酒風味，因此控制麥汁的一致性是實現(xiàn)啤酒風味一致性的關(guān)鍵。但作為農(nóng)副產(chǎn)品原料——大麥(或麥芽)，會受品其種、種植區(qū)域、種植環(huán)境及制麥工藝的影響，從而使麥芽品質(zhì)產(chǎn)生較大波動。因此準確預(yù)測大麥(或麥芽)的性能，確定品種性能差異，是保證麥汁及啤酒一致性的關(guān)鍵。

通常人們用糖化力來評價麥芽淀粉水解能力，文獻報道以及實際釀造過程中發(fā)現(xiàn)，糖化力接近的麥芽其淀粉水解能力差異很大，因此國外更傾向于使用淀粉酶系活力代替糖化力，來預(yù)測麥芽的淀粉水解能力。

本實驗分析了不同品種淀粉酶系活力，明確了搭配對麥芽淀粉酶活力的協(xié)同作用，闡明了高輔料釀造工藝下決定麥汁糖組成的關(guān)鍵酶是極限糊精酶。這為大麥育種、配方使用、糖化工藝調(diào)整以及酶制劑使用提供理論指導意義，從而有效控制麥汁糖組成的一致性以及啤酒風味一致性。

通過分析搭配實驗中麥芽指標和麥汁糖組分的關(guān)系，得出了麥芽浸出率、α-淀粉酶活力、極限糊精酶活力、配方麥芽中加麥使用比例及澳麥使用比例與13°P麥汁中不可發(fā)酵性糖的比例之間的等量關(guān)系，這為實際生產(chǎn)中保證麥汁和啤酒的一致性，提供了有效的指導。

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