淫羊藿苷對(duì)微重力下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與凋亡的影響

張芳+閆海洋+陳旭義

[摘要] 目的 探討淫羊藿苷（ICA）對(duì)微重力下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖與凋亡的影響。 方法 將BMSCs隨機(jī)分為3組：微重力組、加藥組和對(duì)照組，其中微重力組固定于平行平板旋轉(zhuǎn)微重力效應(yīng)模擬器于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加藥組將微重力和1×10-6 mol/L ICA同時(shí)應(yīng)用于細(xì)胞，對(duì)照組正常培養(yǎng)，不進(jìn)行任何附加操作。采用MTT法檢測BMSCs增殖，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測BMSCs凋亡，每組細(xì)胞分3次測量；實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測BMSCs凋亡相關(guān)基因，每個(gè)樣本的每種基因設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；透射電鏡（TEM）觀察BMSCs亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果 MTT法檢測顯示，微重力組吸光度值顯著低于對(duì)照組（P < 0.01），加藥組細(xì)胞吸光度值明顯高于對(duì)照組（P < 0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，微重力組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P < 0.01）；加藥組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組（P < 0.01）。qPCR檢測提示，微重力組Bcl-2、Bax/Bcl-2、P53和Bax的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高（均P < 0.05）；加藥組P53、Bcl-2、Bax和Bax/Bcl-2的表達(dá)均較微重力組顯著降低（均P < 0.01）。透射電鏡下可見，加藥組細(xì)胞形態(tài)大致正常，與對(duì)照組比較，未發(fā)生明顯變化，微重力組部分細(xì)胞可見細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞膜表面微絨毛顯著減少甚至消失，胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集在一起，細(xì)胞核均一固縮，染色質(zhì)濃縮致密、呈向核膜下聚集。 結(jié)論 微重力可抑制BMSCs增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但適當(dāng)濃度ICA可逆轉(zhuǎn)微重力所引起的這種有害影響，對(duì)BMSCs起相應(yīng)的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；淫羊藿苷；微重力；增殖；凋亡

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（a）-0010-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of icariin （ICA） on the proliferation and apoptosis of bone mesenchymal stem cell （BMSCs） under microgravity. Methods The BMSCs were randomly divided into three groups： microgravity group， dosing group and control group. The microgravity group and dosing group was treated with microgravity， besides， 1×10-6 mol/L ICA was applied to the cells in dosing group； the control group was cultured without any additional operation. Cell proliferation was detected by MTT assay， each group was set up 3 reduplicateholes； the apoptosis was detected by FCM， each group was detected 3 times； the expression of apoptosis related genes were detected by QPCR with 3 reduplicate holes， and the subcellular structure was observed by TEM. Results The result of MTT examination showed that the absorbance value of microgravity group was significantly lower than that of the control group （P < 0.01）， and the dosing group was significantly higher than that of the control group （P < 0.01）. FCM method showed that the apoptosis rate of microgravity group was significantly higher than control group （P < 0.01）， and the apoptosis rate of the dosing group was significantly lower than control group （P < 0.01）. Compared with the control group， the expression of Bcl-2， Bax/bcl-2， Bax， and P53 gene was up-regulated in microgravity group （all P < 0.05）； in dosing group， the expression of Bax， Bcl-2， P53 and the Bax/bcl-2 gene was significantly down-regulated when compared with microgravity group （all P < 0.01）. TEM indicated that the dosing group cells were generally normal and with no obvious changes when compared with the control group； in microgravity group， the cells existed membrane shrinking， microvilli decreasing， cytoplasmic concentration， ribosome and mitochondria gathering， nucleus pyknosis， and dense chromatin gathering to the margin of nuclear membrane. Conclusion Microgravity can inhibit osteoblast′s proliferation and promote apoptosis of BMSCs. But the appropriate concentration of ICA can protect BMSCs from the harmful effect caused by microgravity.endprint

[Key words] Bone mesenchymal stem cell； Icariin； Microgravity； Proliferation； Apoptosis

淫羊藿又名洋火葉、棄杖草等，是小檗科多年生草本植物淫羊藿干燥莖葉，《中華人民共和國藥典》2015版中記載其有“補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕”的功效[1]。研究表明，淫羊藿在骨損傷修復(fù)和抗骨質(zhì)疏松治療方面有著優(yōu)良的生物活性[2]。現(xiàn)代中藥藥理學(xué)認(rèn)為淫羊藿的主要有效成分是黃酮類化合物淫羊藿苷（icariin，ICA），其可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與骨代謝，并改善心腦血管功能、免疫功能、性腺功能及抗腫瘤等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ICA可增強(qiáng)BMSCs的增殖活性和成骨活性，有效促進(jìn)骨形成，對(duì)于骨損傷后的修復(fù)起重要作用[3-4]。然而，很少有研究集中在ICA與微重力刺激相結(jié)合時(shí)對(duì)BMSCs增殖與凋亡的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過探討ICA聯(lián)合微重力對(duì)BMSCs增殖與凋亡的影響，為ICA治療骨相關(guān)疾病提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠5只，體重200～230 g，購自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（動(dòng)物合格證號(hào)：0042523），5只/籠，12 h光照/d，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與儀器

ICA（LCA-W-120602，北京中國藥品生物制品檢定所），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（C1063，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），qPCR試劑盒（Cll7330 38，Invitogen，美國），小鼠抗CD44單克隆抗體（A3D8，Sigma，美國），小鼠抗CD45單克隆抗體（YY-1773R，Abcam，英國），平行平板旋轉(zhuǎn)微重力效應(yīng)模擬器（EQUL-3DR，NUNC，丹麥）；酶標(biāo)儀（TECAN Infinite 200Pro，瑞士）；流式細(xì)胞儀（Bio-Plex200，Bio-Rad，美國），實(shí)時(shí)定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad，美國）；透射電鏡（HT7700，日立，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SD大鼠BMSCs原代分離、培養(yǎng)、純化及鑒定 取7周齡大鼠脫頸處死，無菌條件下取股骨和脛骨，按牟歡等[5]的方法分離培養(yǎng)BMSCs。采用流式細(xì)胞儀利用BMSCs表面分子標(biāo)志物CD44、CD45鑒定BMSCs。

1.3.2 分組 取對(duì)數(shù)生長期（5×106/瓶）的第3代細(xì)胞常規(guī)消化，計(jì)數(shù)將1×105個(gè)BMSCs用移液槍接種至旋轉(zhuǎn)平行平板腔，采用完全隨機(jī)化分組方法分為對(duì)照組、微重力組、10 μg/L ICA和微重力組（加藥組）。平板腔內(nèi)加滿培養(yǎng)基，注意避免產(chǎn)生氣泡，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基。將微重力組和加藥組置于旋轉(zhuǎn)模擬微重力效應(yīng)器并放入培養(yǎng)箱使其在轉(zhuǎn)速為10 r/min的條件下運(yùn)轉(zhuǎn)，連續(xù)4 d，每2天更換1次培養(yǎng)基，對(duì)照組同步置于培養(yǎng)箱中。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，每瓶加入2 mL MTT液，37℃避光孵育4 h，棄去液體，各瓶加入2 mL二甲基亞砜振蕩15 min。每組細(xì)胞在96孔板上均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔分別吸取200 μL，用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm波長下的吸光度值。

1.4.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，2000 r/min離心10 min，用1/15 mol/L PBS洗滌4次，重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)至5×105，按試劑盒說明加入相關(guān)試劑，室溫條件下避光孵育15 min；使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm，每組重復(fù)3次。

1.4.3 qPCR檢測mRNA表達(dá) 用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)Bax、Bcl-2、P53、GAPDH引物（表1）。依說明書提取各組細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR反應(yīng)體系為25 μL，根據(jù)Nano Drop定量結(jié)果，體系中包含25 ng cDNA，各引物終濃度均為400 nmol/L。每一組的每種基因均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件均采用兩步法：95℃ 3 min預(yù)變性，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，行融解曲線分析，應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 透射電鏡檢測細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化 取實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，1/15 mol/L PBS洗滌，2000 r/min離心10 min，4%戊二醛固定12 h，4℃條件下送南開大學(xué)電鏡室。按透射電鏡制片步驟制片，完成后于透射電鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs生長特點(diǎn)及鑒定結(jié)果

原代BMSCs培養(yǎng)6～8 d后可見細(xì)胞呈梭形、紡錘形貼壁生長，形態(tài)逐漸趨向一致，在11～15 d后BMSCs基本融合鋪滿培養(yǎng)瓶呈典型的旋渦狀生長或放射狀生長。傳代后BMSCs仍呈均一梭形貼壁生長，6～8 d基本達(dá)到融合狀態(tài)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs表面抗原，顯示CD44、CD45陽性細(xì)胞比率分別為98.96%、12.23%，符合BMSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[6]。見圖1。

2.2 MTT法檢測結(jié)果

微重力組吸光度值顯著低于對(duì)照組[（1.65±0.03） vs. （2.14±0.04），P < 0.01]，加藥組細(xì)胞吸光度值明顯高于對(duì)照組和微重力組[（2.41±0.03） vs. （2.14±0.04），P < 0.01]。見圖2。endprint

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

微重力組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組[（0.116±0.004） vs. （0.046±0.002），P < 0.01]；加藥組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組[（0.027±0.002） vs. （0.046±0.002），P < 0.01]。見圖3。

2.4 qPCR結(jié)果

微重力組P53、Bcl-2、Bax和Bax/Bcl-2的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高（均P < 0.05）；加藥組P53、Bcl-2、Bax和Bax/Bcl-2的表達(dá)均較微重力組顯著降低（均P < 0.01）。見圖4。

2.5 透射電鏡亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果

透射電鏡下觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，加藥組細(xì)胞形態(tài)大致正常，與對(duì)照組比較，未發(fā)生明顯變化。微重力組部分細(xì)胞可見細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞膜表面微絨毛顯著減少甚至消失，胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集在一起，細(xì)胞核均一固縮，染色質(zhì)濃縮致密、呈向核膜下聚集的趨勢，呈早期凋亡現(xiàn)象（圖5）。

3 討論

隨著我國太空探索活動(dòng)越來越深入，太空微重力環(huán)境所致的骨量丟失是威脅航天員健康的主要問題之一[6]。骨代謝的平衡穩(wěn)定主要取決于成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨生成與破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收，而重力刺激和機(jī)械力學(xué)載荷則對(duì)其動(dòng)態(tài)穩(wěn)衡有著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[7]。研究證實(shí)，微重力所導(dǎo)致的骨量丟失主要是因?yàn)楣谴x平衡狀態(tài)被打破，骨組織礦化障礙導(dǎo)致[8-9]。BMSCs起源于骨髓基質(zhì)，成骨細(xì)胞則是由BMSCs在機(jī)體多種調(diào)控因素的調(diào)控下分化而來。近年來有學(xué)者研究證實(shí)微重力條件下BMSCs在形態(tài)、增殖及分化方面發(fā)生一系列變化[10-11]。ICA對(duì)骨生成和BMSCs的增殖與分化有著重要的調(diào)控作用[12]。本實(shí)驗(yàn)將ICA聯(lián)合微重力來探索其對(duì)BMSCs增殖與凋亡的影響。

結(jié)果顯示，微重力可抑制BMSCs增殖、誘導(dǎo)并激活BMSCs凋亡，加藥組則可顯著提高BMSCs活性并抑制BMSCs凋亡。黃國平等[13]研究發(fā)現(xiàn)微重力環(huán)境中BMSCs細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，細(xì)胞增殖明顯被抑制，在微重力環(huán)境中時(shí)間越長，這種現(xiàn)象愈明顯，這可能是由于胞內(nèi)游離狀態(tài)的β-catenin mRNA含量降低導(dǎo)致經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制所引起[14]。加入淫羊藿苷后，BMSCs增殖活性明顯增高，與劉天麟等[15]研究結(jié)果類似，其以犬BMSCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象同樣發(fā)現(xiàn)ICA對(duì)BMSCs增殖、骨向分化有促進(jìn)作用。

透射電鏡檢測結(jié)果表明，微重力可誘導(dǎo)BMSCs凋亡，而加用ICA后，凋亡被顯著抑制。這可能與ICA通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān)。Bax基因與Bcl-2基因是一對(duì)同源性較高但功能完全不同的同一家族成員。Bax基因過表達(dá)時(shí)可形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制增殖；Bcl-2基因過表達(dá)時(shí)可與Bax基因形成異源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡[16-18]。Bax基因和Bcl-2基因作為細(xì)胞凋亡正負(fù)向調(diào)控基因，兩者的表達(dá)比（Bax/Bcl-2）不但決定細(xì)胞凋亡是否啟動(dòng)，還能反映凋亡的進(jìn)展程度，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控有著不可或缺的作用[19-20]。結(jié)果顯示微重力可顯著促進(jìn)Bax表達(dá)，而應(yīng)用ICA后Bax表達(dá)受到抑制，同時(shí)Bax/Bcl-2比值也顯著降低，提示ICA對(duì)凋亡起到抑制作用。P53基因可與受損DNA結(jié)合，使細(xì)胞停滯在G1期而不能進(jìn)入S期，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16-18]。ICA的應(yīng)用，同樣抑制P53的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述，微重力可抑制BMSCs增殖、促進(jìn)BMSCs凋亡，但適當(dāng)濃度（1×10-6 mol/L）的ICA能有效逆轉(zhuǎn)微重力所引起的這種有害影響，對(duì)BMSCs起相應(yīng)的保護(hù)作用。該研究可促進(jìn)對(duì)ICA聯(lián)合微重力因素對(duì)骨重建作用機(jī)制的了解，為臨床骨保護(hù)藥物的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)，對(duì)臨床治療骨關(guān)節(jié)相關(guān)疾病具有重要意義。

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（收稿日期：2017-09-26 本文編輯：王 瓊）endprint