響應面法優(yōu)化美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取工藝

郭磊，肖志暉，李鵬，闞歡，劉云

(西南林業(yè)大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，昆明 650224)

美味牛肝菌(Boletusedulis)，別名白牛肝菌、大腳菇，屬真菌界(Fungi)，真菌門(Eumycota)，擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，牛肝菌科(Boletaceae)，牛肝菌屬(Boletus)[1]。美味牛肝菌含有蛋白質(zhì)、脂肪、黃酮類化合物、三萜類化合物、多糖等多種營養(yǎng)成分[2-6]，而提取物具有抗氧化、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[7]。在北美洲、歐洲北至斯堪的納維亞半島，南到希臘、意

大利的大部分地方、拉丁美洲的墨西哥以及整個亞洲均有分布[8]，中國是美味牛肝菌的主要分布區(qū)域，在云南有廣泛分布[9]。

食用菌的揮發(fā)性香氣成分主要包括揮發(fā)性八碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯類等，其中揮發(fā)性八碳化合物是食用菌最重要的風味物質(zhì)[10]。香味物質(zhì)在食品中含量很低，一般在ppb水平[11]。常用的食品風味物質(zhì)的提取方法有溶劑萃取法、常規(guī)水蒸氣蒸餾法、超臨界萃取法、頂空收集法、同步蒸餾萃取法及固相微萃取法[12]。同時蒸餾萃取法(SDE)是一種提取、分離和富集試樣中揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分的有效方法[13]，廣泛應用于食品分析、香精香料、藥物化學等行業(yè)的樣品分析前處理中[14]。常用的有機溶劑有正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙醋、正戊烷等。

近年來，隨著生活水平和消費需求的不斷提高，人們已經(jīng)不再滿足于大眾化的調(diào)味品，更加偏好于風味獨特的調(diào)味料，這對調(diào)味品行業(yè)的發(fā)展提出了更高的要求，美味牛肝菌風味獨特，營養(yǎng)價值高，可開發(fā)出滿足廣大消費者需求的新型天然調(diào)味料。目前對美味牛肝菌及其加工制品的風味組成及變化的研究鮮見報道。

本研究通過同時蒸餾萃取法對美味牛肝菌干制品進行揮發(fā)性風味物質(zhì)的提取，并通過Box-Benhnken響應面分析法優(yōu)化風味物質(zhì)的萃取條件，為研究云南美味牛肝菌的風味成分并進一步為研發(fā)天然牛肝菌調(diào)味品提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國 Agilent 科技有限公司；同時蒸餾萃取裝置(定制)；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理與同時蒸餾萃取

云南美味牛肝菌在35 ℃下烘6 h，超微粉碎后過50目篩備用。

準確稱取一定量的菌粉，放入SDE裝置的1000 mL圓底燒瓶中，加入一定量的蒸餾水和氯化鈉并混合均勻，加熱至沸騰。裝置另一端的圓底燒瓶盛放一定量的正己烷溶液，放于水浴鍋中，兩端同時加熱進行蒸餾萃取。一定時間后，降至室溫置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮除去正己烷，稱重計算提取量。

1.2.2 單因素實驗

以正己烷為萃取溶劑，以揮發(fā)性風味物質(zhì)萃取量為實驗指標，研究萃取時間(h)、萃取溫度(℃)、溶劑加入量(mL)、料液比(g/mL)等因素對云南美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)萃取量的影響。因素水平如下：固定萃取溫度75 ℃，溶劑加入量50 mL，料液比1∶40(g/mL，下同)，考察不同的萃取時間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)對萃取量的影響；固定萃取時間1h，溶劑加入量50 mL，料液比1∶40(g/mL)，考察不同的萃取溫度(60，65，70，75，80 ℃)對萃取量的影響；固定萃取時間1 h，萃取溫度75 ℃，考察不同的溶劑加入量(30，40，50，60，70 mL)對萃取量的影響；固定萃取時間1 h，萃取溫度75 ℃，溶劑加入量50 mL，考察不同的料液比(1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50)對萃取量的影響。

從現(xiàn)場變形跡象來看：后緣以連續(xù)拉張裂縫、錯落坎等變形跡象為主，局部出現(xiàn)坍滑現(xiàn)象，該工程邊坡后緣風化巖體剝離，主要受優(yōu)勢節(jié)理裂隙影響，目前整體邊坡無大變形跡象。

1.2.3 Box-Benhnken中心組合試驗設計

在單因素實驗結(jié)果的基礎上，選擇影響萃取量較大的3個因素如萃取時間(h)、溶劑加入量(mL)、料液比(g/mL)為研究對象，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設計的原理，采用三因素三水平響應曲面分析方法，以萃取量為響應值，試驗因素與水平的設計見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用F檢驗對獲得的數(shù)據(jù)進行方差分析并評價模型的統(tǒng)計意義，數(shù)據(jù)分析軟件采用Design Expert 6.0.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 時間對萃取量的影響

圖1 時間對萃取量的影響Fig.1 Effect of time on the extraction content

由圖1可知，美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取量隨著時間的延長先增加后減少，在萃取時間為1 h時達到最大，隨后逐漸減少。隨著萃取時間的增加，風味物質(zhì)被萃取得比較完全，但當時間延長，由于本身的揮發(fā)造成損失的作用越來越大，含量逐漸減少。因此，最適萃取時間為1 h。

2.1.2 溫度對萃取量的影響

圖2 溫度對萃取量的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction content

由圖2 可知，隨著溫度的升高，美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取量先增加后趨于平衡，在溫度為75 ℃時達到最大。隨著溫度的升高，正己烷由于達到自身沸點能夠較好地萃取出揮發(fā)性風味物質(zhì)，但溫度的持續(xù)升高，正己烷蒸發(fā)過快造成萃取量稍稍減少，甚至部分物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定而發(fā)生化學變化。因此，最適萃取溫度為75 ℃。

2.1.3 溶劑加入量對萃取量的影響

圖3 溶劑加入量對萃取量的影響Fig.3 Effect of solvent volume on the extraction content

由圖3可知，隨著溶劑加入量的不斷增加，美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取量先增加后減少，當溶劑加入量為50 mL時達到最大。溶劑加入量增大會萃取更多的揮發(fā)性風味物質(zhì)，但溶劑加入量過多，后期的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間也較長，可能帶出較多的風味物質(zhì)，不利于收集。因此，最適溶劑加入量為50 mL。

2.1.4 料液比對萃取量的影響

圖4 料液比對萃取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction content

由圖4可知，隨著固液比的增加，美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取量先增加后減少，在固液比為1∶40時達到最大。固液比的增加會增大樣品間的疏散性，使得萃取量有較大增加，但固液比超過一定的值后，揮發(fā)性風味物質(zhì)可能一部分溶在熱水里而造成萃取量下降。因此，最適固液比為1∶40。

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面實驗方案及結(jié)果

在單因素結(jié)果的基礎上，由 Design-Expert 6.0.5設計出的實驗方案及結(jié)果見表2，以揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取量為響應值，以影響萃取量較大的3個因素萃取時間(A)、 溶劑加入量(B)、 料液比(C)為自變量，建立三因素三水平的中心組合實驗設計，實驗結(jié)果，見表2。

表2 Box-Benhnken實驗設計及其實驗結(jié)果Table 2 Box-Benhnken test design and results

續(xù) 表

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert 6.0.5對所得的實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果見表3，對各因素進行回歸擬合后得回歸方程：

Y=-20.37+5.61A+0.03B+1.03C-1.66A2-0.0014B2-0.01C2+0.0023AB-0.02AC+0.0029BC。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：**，P<0.01為極顯著；*，P<0.05為顯著。

回歸模型的R2=0.7531，RAdj2=0.9487，可知回歸方程模型極顯著(p<0.0001)，該模型與實際擬合良好，實驗方法可靠，失擬項不顯著(p>0.05)，所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可用此回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。結(jié)果表明C，A2，B2，C2，BC對響應值影響顯著。

2.2.3 響應面圖分析

對二次多項回歸方程所做的相應曲面圖見圖5。通過三組動態(tài)圖可對任何兩因素交互影響萃取效應進行分析與評價，并確定最佳因素范圍。

圖5 兩因素的交互作用對多糖得率的響應面圖Fig.5 The interaction of the two factors on the response surface of polysaccharide yield

圖5分別顯示了萃取時間、溶劑加入量、料液比為零水平時，萃取時間(h)和溶劑加入量(mL)、萃取時間(h)和料液比(g/mL)、溶劑加入量(mL)與料液比(g/mL)對美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)萃取量的交互影響效應。3個圖中萃取量都隨任意2個變量的增加呈上升趨勢，達到某一定值時，曲面稍下降或趨于平緩。

2.2.4 驗證實驗

對回歸方程進行求解，即萃取量最大值時的萃取條件為萃取時間1.46 h、溶劑加入量56.48 mL、料液比1∶42.28(g/mL)，最大萃取量達到6.27 mg/g，為方便實際操作將實驗條件定為萃取時間1.5 h、溶劑加入量55 mL、料液比1∶40。取3等份美味牛肝菌粉進行平行實驗，所得平均萃取量為5.98 mg/g，經(jīng)回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合，證明此響應面法可以有效優(yōu)化美味牛肝菌揮發(fā)性風味成分的萃取工藝。

3 結(jié)論

目前，市場上的食用菌類調(diào)味品逐漸增多，但大多為干制油炸等粗加工產(chǎn)品，生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)的調(diào)味料中食用菌的鮮香味營養(yǎng)成分物質(zhì)未被充分釋放出來[15]。美味牛肝菌具有獨特的鮮香氣味，將其做成風味獨特、香味濃郁的天然調(diào)味品或者天然復合風味調(diào)料必定有著廣闊的市場前景。

美味牛肝菌是具有云南特色的優(yōu)勢資源，本文采用同時蒸餾萃取法對美味牛肝菌的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行萃取，建立了美味牛肝菌揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取回歸模型，并優(yōu)化出揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取工藝條件。為分析美味牛肝菌揮發(fā)性風味成分的釋放規(guī)律及進一步開發(fā)出美味牛肝菌復合調(diào)味料提供了一定的技術條件，具有一定的實用價值。

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