反相高效液相色譜法測定酚氨咖敏片的含量及其均勻度

王麗瓊

（四川省樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

酚氨咖敏片主要適用于感冒、發(fā)熱、頭痛、神經(jīng)痛及風濕痛等，其為復方制劑，主要成分為氨基比林、對乙酰氨基酚、咖啡因和馬來酸氯苯那敏，價格便宜，文獻報道的不良反應有肝損害[1]、白細胞減少[2]、嚴重皮疹[3]等，還存在主要成分對乙酰氨基酚的安全性問題[4]?，F(xiàn)行標準[5]中采用高效液相色譜（HPLC）法分別測定上述4種成分的含量，氯苯那敏出峰時間約為23 min，對乙酰氨基酚峰和咖啡因峰分離度差，且操作煩瑣，耗時長。有人采用HPLC法同時測定酚氨咖敏顆粒中上述4種成分的含量[6]，以及酚氨咖敏片中咖啡因與馬來酸氯苯那敏的含量均勻度[7]，但均僅洗脫出馬來酸峰，未洗脫出氯苯那敏峰。還有人采用HPLC法測定酚氨咖敏片中氨基比林、對乙酰氨基酚和咖啡因的溶出度[8－9]，以及馬來酸氯苯那敏含量均勻度[10]，采用氣相色譜（GC）法同時測定酚氨咖敏片中4種成分的含量[11]，采用近紅外漫反射光譜法測定酚咖片中對乙酰氨基酚和咖啡因的含量[12]。但尚未見采用HPLC法同時測定酚氨咖敏片4種主要成分含量及其均勻度的報道。本研究中采用常用的C18柱和簡單的二元流動相，以梯度洗脫提高分離性能，建立了能同時測定酚氨咖敏片4種組分含量的質(zhì)量控制方法，同時對咖啡因和馬來酸氯苯那敏的含量均勻度進行了考察?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器和OpenLAB CDS色譜工作站（美國Agilent公司）；XS205 DualRange型電子天平，SevenMulti型酸度計（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

氨基比林對照品（批號為100503－201302，純度為99．9%），對乙酰氨基酚對照品（批號為 100018－201409，純度按 99．9% 計），咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ枮?71215－201010，純度按 100．0%計），馬來酸氯苯那敏對照品（批號為 100047－201507，純度按 99．7%計）均購自中國食品藥品檢定研究院；酚氨咖敏片（云南白藥集團大理藥業(yè)有限責任公司，批號分別為DLA1586，DHA1628，DMA1610）；甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀、三乙胺、磷酸、糊精、羧甲淀粉鈉、二氧化硅和硬脂酸鎂均為分析純，馬鈴薯淀粉為生物試劑，試驗用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Waters XTerra? RP18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：A 為甲醇，B 為 0．02 mol／L 磷酸二氫鉀溶液 － 三乙胺（100 ∶0．02），梯度洗脫（0～15 min，A 相20%→75%；15～16 min，A 相 75%→20%；16～21 min，A 相 20%）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；檢測波長：215 nm；進樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

對照品溶液：稱取氨基比林對照品100．36 mg，對乙酰氨基酚對照品 150．00 mg，咖啡因?qū)φ掌?29．98 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用25%甲醇（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3．5）溶解；精密稱取馬來酸氯苯那敏對照品10．84 mg，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置上述50mL容量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取25 mL，置100 mL容量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

供試品溶液：取樣品20片，稱定，計算平均單片質(zhì)量，稱取適量（約相當于對乙酰氨基酚150 mg），置200 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

溶劑空白溶液：25%甲醇（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3．5)。

陰性對照品溶液：按處方比例取空白輔料，同供試品溶液配制方法制備，即得。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 方法學考察

陰性干擾試驗：分別取2．2項下3種溶液及溶劑空白溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。在擬訂色譜條件下，4個組分可完全分離。理論板數(shù)按對乙酰氨基酚峰計算為13 345；馬來酸峰與對乙酰氨基酚峰的分離度為16．11，對乙酰氨基酚峰與咖啡因峰的分離度為5．52，咖啡因峰與氨基比林峰的分離度為14．63，氨基比林峰與氯苯那敏峰的分離度為13．44。結(jié)果表明，在擬訂色譜條件下，4個測定組分（5個峰）分離好，溶劑和輔料在對照品溶液4組分（5個峰）相應保留時間處無色譜峰，陰性對照無干擾。

定量限確定：稱取各組分對照品適量，精密穩(wěn)定，加25%甲醇溶解并稀釋制成氨基比林、對乙酰氨基酚、咖啡因和馬來酸氯苯那敏質(zhì)量濃度分別為 0．25，0．37，0．15，1．08 μg／mL 的溶液，按 2．1 項下色譜條件進樣分析。結(jié)果見表1。

線性關(guān)系考察：精密量取對照品貯備液 0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加 25%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取各溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各組分峰面積（A）為縱坐標、質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果見表1。

精密度試驗：精密量取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果見表1，可見儀器精密度良好。

重復性試驗：取批號為DMA1610的酚氨咖敏片樣品，依法制備6份供試品溶液，精密量取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以樣品中4組分標示量的百分含量計算。見表1?？梢姡椒ㄖ貜托苑弦?。

加樣回收試驗：精密稱取氨基比林、對乙酰氨基酚和咖啡因的對照品及片劑中的其他組分，按處方量的100%，分別置6個200 mL容量瓶中，加適量25%甲醇溶解；精密稱取馬來酸氯苯那敏對照品20 mg，置50 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，分別置上述相應的200 mL容量瓶中，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得每個組分6份供試品溶液。精密量取以上6種溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，計算加收率。結(jié)果見表2。

穩(wěn)定性試驗：取批號為DMA1610的樣品，依法制備供試品溶液，室溫放置，分別于 0，2，4，6，8，12，24，36，48 h精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。結(jié)果見表1，可見明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

耐用性試驗[13]：取對照品溶液，分別采用不同柱溫（29．0，29．5，30．0，30．5，31．0 ℃ ）和不同流速（0．990，0．995，1．000，1．005，1．010 mL ／min），其他條件同 2．1項，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。結(jié)果見表1，可見在測定條件有微小變動時，測定結(jié)果不受影響，系統(tǒng)耐用性好。

表1 方法學考察試驗結(jié)果

表2 回收率試驗結(jié)果（n＝6）

表3 樣品含量測定結(jié)果（%，n＝3）

2．4 樣品含量測定

取批號為DLA1586，DHA1628，DMA1610的酚氨咖敏片各3份，依法制備供試品溶液。精密量取各溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算樣品含量。結(jié)果見表3。

2．5 樣品含量均勻度測定

取批號為DLA1586，DHA1628，DMA1610的酚氨咖敏片各1片，分別置200 mL容量瓶中，加適量25%甲醇，超聲助溶，放冷，用25%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取各溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，進樣10次，記錄色譜圖。按外標法測定峰面積，計算樣品含量，并根據(jù)2015 年版《中國藥典（四部）》（通則 0941）[14]計算含量均勻度（A ＋2．2 S），結(jié)果均符合要求。詳見表4。

表4 樣品含量均勻度測定結(jié)果(n＝10)

3 討論

3．1 色譜條件考察

波長選擇：根據(jù)4種成分的紫外光譜圖（200～400 nm）進行分析[15]。馬來酸氯苯那敏在215 nm波長處的吸收度約為其特征波長261 nm處的3倍，氨基比林和咖啡因的吸收度和其特征波長相近，對乙酰氨基酚的吸收度最小，而對乙酰氨基酚的處方量最大，馬來酸氯苯那敏的處方量最小。綜合考慮，選擇215 nm波長較合適。

流動相選擇：試驗中比較了流動相B分別為0．02 moL ／L 磷酸二氫鉀溶液或 0．02 moL ／L 磷酸二氫鉀溶液 －三乙胺（100∶0．02）對色譜峰的影響。結(jié)果顯示，無三乙胺時氨基比林峰的對稱性差，選用后者為流動相。同時比較了梯度洗脫與等度洗脫對分離效能的影響。4種組分（5個峰）理化性質(zhì)不一致，當采用甲醇－0．02 mol／L 磷酸二氫鉀溶液 － 三乙胺（20 ∶80）為流動相等度洗脫時，氯苯那敏不出峰，氨基比林出峰時間約為19 min，且峰展寬，采用梯度洗脫提高甲醇比例，有利于氯苯那敏和氨基比林峰的分離。經(jīng)過考察，在此梯度洗脫程序下，4組分（5個峰）在13 min內(nèi)全部洗脫出來，各峰間分離度好，氨基比林峰窄而尖。

3．2 樣品溶劑選擇

本研究中比較了95%乙醇、無水乙醇、25%甲醇、25%甲醇（分別用 10% 磷酸調(diào) pH 至 3．5，2．5，1．5）6 種溶劑對各組分提取效果的影響。結(jié)果采用95%乙醇和無水乙醇提取的樣品溶液色譜圖中對乙酰氨基酚峰和咖啡因峰有肩峰，且峰展寬；采用25%甲醇（用10%磷酸調(diào)pH至2．5和1．5）提取的樣品溶液色譜圖中氨基比林峰形差，峰展寬，拖尾；25%甲醇對氯苯那敏的提取率低。經(jīng)過考察，最后選用25%甲醇（用10%磷酸調(diào)pH至 3．5）為溶劑。

3．3 應用價值

現(xiàn)行法定標準采用HPLC等度洗脫法分2次測定酚氨咖敏片中4組分的含量。本研究方法優(yōu)勢在于：一是采用HPLC法同時測定了酚氨咖敏片4組分含量，考察了咖啡因和馬來酸氯苯那敏的含量均勻度，操作簡便，氯苯那敏出峰時間約縮短一半；二是色譜圖中，對乙酰氨基酚峰和咖啡因峰分離度升高2倍多，分離效能大幅提高；三是檢測波長處馬來酸氯苯那敏紫外吸收強度提高了3倍，檢測靈敏度明顯升高?？梢?，本方法簡便、快速、準確，適用于酚氨咖敏片的質(zhì)量評價。

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