清補(bǔ)通絡(luò)濃縮丸提取工藝優(yōu)化研究*

清補(bǔ)通絡(luò)濃縮丸是新疆維吾爾自治區(qū)第六人民醫(yī)院的純中藥制劑，由黃芩、黨參、丹參、赤芍、柴胡、黃芪、枳殼、防己、當(dāng)歸、獨(dú)活、川芎、川牛膝、元胡、地龍、甘草等中藥組方，具有補(bǔ)氣扶正、活血化瘀、清熱祛濕、通絡(luò)止痛的功效，主要用于治療布魯氏桿菌病，癥見乏力、神疲倦怠、發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹疼痛、肌肉酸痛等。該藥起初為水丸，后為方便患者攜帶和服用，以及減少服用劑量，改為濃縮丸。本研究中將清補(bǔ)通洛丸中除丹參、赤芍、枳殼、元胡外的其他11味藥進(jìn)行提取，納入每次提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等多個(gè)因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并以浸膏得率和浸膏中的黃芩苷含量為考察指標(biāo)，探討清補(bǔ)通絡(luò)濃縮丸最佳提取工藝，為其制劑試生產(chǎn)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC20－10A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE－3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA2204型電子秤（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；WS70－1型紅外干燥箱（鞏義市英峪予儀器廠）；優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；AS265－S型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；AP－01P型真空泵（天津歐特塞恩斯儀器有限公司）。

試藥：蒸餾水；色譜甲醇（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；甲醇（分析純）、磷酸均購自天津市百世化工有限公司；黃芩苷對照品（批號(hào)為110715－201318，中國食品藥品檢定研究院）；當(dāng)歸（批號(hào)為 16030401－3）、黃芪（批號(hào)為 15082801－8）、黨參（批號(hào)為 16033302－5）、丹參（批號(hào)為 16070101－1）、赤芍（批號(hào)為 15082901－5）、柴胡（批號(hào)為 16032501－2）、黃芩（批號(hào)為 15121502－2）、防 己 （批 號(hào) 為 16010501－3）、獨(dú) 活 （批 號(hào) 為16042702 － 1）、川芎（批號(hào)為 16051001－4）、枳殼(批號(hào)為15111201－5)、川牛膝（批號(hào)為 16011101－5）、元胡（批號(hào)為 15061402 － 4）、地龍（批號(hào)為 15121105）、甘草（批號(hào)為16021701－4）中藥材均購于新疆奇康哈博中維藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2．1 黃芩苷含量測定

2．1．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Luna C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 － 水 － 磷酸（47 ∶53 ∶0．2）；檢測波長：280 nm[5]；流速：1 mL ／min；柱溫：30 ℃ 。色譜圖見圖 1?？梢姡幮詫φ掌啡芤涸邳S芩苷出峰位置處未出現(xiàn)吸收峰，表明處方中其他藥材對黃芩苷的含量測定無干擾。

2．1．2 溶液制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為 94．6 μg／mL的溶液，即得對照品溶液。按處方比例取11味中藥材，粉碎，過3號(hào)篩，稱取5 g，精密稱定，置圓底燒瓶，加入50 mL蒸餾水，回流提取1 h，提取1次，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤?0%乙醇 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲 30 min，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液2．5 mL，置25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取樣品適量，加入相應(yīng)量對照品溶液，搖勻，即得混合對照品溶液。按處方比例取除黃芩以外所有藥材，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2．1．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對照品溶液 0．4，2．0，4．0，6．0，8．0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。按2．1．1項(xiàng)下條件測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝33 894X－1 614．2，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié) 果 表明 ，黃 芩 苷 質(zhì) 量 濃 度 在3．78 ～ 75．68 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液，重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL。結(jié)果峰面積平均積分值為3 109 045，RSD為2．63%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取6份樣品，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果平均含量為 4．21 mg／g，RSD 為 2．71%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)精密吸取并進(jìn)樣，依法測定。結(jié)果平均峰面積為 1 459 199，RSD 為 2．07% （n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知黃芩苷含量的清補(bǔ)通絡(luò)濃縮丸適量，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別精密加入含黃芩苷3．259 2 mg對照品溶液，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

2．2 正交試驗(yàn)優(yōu)選

本試驗(yàn)中，以因素 A（料液比，V∶V），因素 B（每次提取時(shí)間），因素C（提取次數(shù)）為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2至表4。

由表3可見，料液比及提取次數(shù)對檢測指標(biāo)影響較大，各因素對提取中黃芩含量的影響程度依次為提取次數(shù)＞料液比＞提取時(shí)間，因素A中 K3＞K2＞K1，故選擇水平 3，即料液比為 1∶10（V∶V）；因素 C 中 K2＞ K3＞ K1，應(yīng)選擇水平2，即提取2次；每次提取時(shí)間對檢測指標(biāo)影響不大，為方便起見，選擇每次提取1 h。由表4可見，料液比和提取次數(shù)在黃芩苷含量測定中具有顯著性。綜合考慮，確定最佳提取工藝為料液比為1∶10，提取2次，每次提取1 h。對優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，測得黃芩苷含量為 4．49 mg ／g，出膏率為 4．89% ，基本合格。

3 討論

清補(bǔ)通絡(luò)濃縮丸已廣泛用于臨床，對治療布魯氏桿菌病起到了積極作用。該病是由布魯氏桿菌侵入機(jī)體后引起的變態(tài)反應(yīng)性傳染病[1]，可引起多種局部并發(fā)癥，如外周關(guān)節(jié)炎、心力衰竭、流產(chǎn)等，致使布魯氏桿菌病遷延難愈，成為臨床治療和控制的難點(diǎn)[2－3]。西醫(yī)抗菌療法用于急性期布魯氏桿菌病，毒副作用較大，復(fù)發(fā)率較高，不易殺死病菌[4－7]。中藥主要治療慢性期和部分急性期布魯氏桿菌病，毒副作用較小、不易產(chǎn)生耐藥，可改善機(jī)體免疫功能，能達(dá)到標(biāo)本兼治的效果。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 影響因素與水平表

表3 提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析表

表4 方差分析結(jié)果表

黃芩苷為方中黃芩的主要活性成分，具有抗腫瘤[8]、抗炎[9]、抗過敏[10]等作用，尤以抗菌作用最顯著[11]。故本研究中采用高效液相色譜法測定提取液中黃芩苷含量，并計(jì)算浸膏得率，進(jìn)行濃縮丸提取工藝優(yōu)化研究[12－13]。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，料液比及提取次數(shù)對檢測指標(biāo)影響較大，具有顯著性，各因素對黃芩苷提取工藝的影響程度依次為提取次數(shù)＞料液比＞提取時(shí)間，得出最佳提取工藝。經(jīng)驗(yàn)證，在此工藝下黃芩苷含量為4．49 mg／g，出膏率為4．84%，結(jié)果滿意，且此工藝可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，實(shí)用性強(qiáng)，可為大生產(chǎn)提供依據(jù)。中藥新藥清補(bǔ)通絡(luò)濃縮丸制劑工藝的初步研究，為后續(xù)其他中藥新藥的研究開發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，可更好地服務(wù)于布魯氏桿菌病患者，也有利于維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定，有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，符合國家及新疆當(dāng)?shù)氐拿裆?，對推?dòng)我國布魯氏桿菌病的防治工作具有非常重要的意義。

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