TNF-α對(duì)腫瘤微環(huán)境中BMSCs生物學(xué)特性的影響

向中平，崔向榮，譚彬，田杰，朱靜

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易于體外擴(kuò)增、低免疫源性、腫瘤趨化性等優(yōu)勢，已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[1-3]，然而間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤治療中的安全問題目前尚未解決[4]。研究報(bào)道，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是由巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等產(chǎn)生的促炎因子[5]，其作用具有劑量依賴性，低濃度的TNF-α能夠?qū)е录?xì)胞DNA損壞、活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-7]。本研究通過BMSCs與C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞間接共培養(yǎng)以模擬體外BMSCs腫瘤生長的微環(huán)境，進(jìn)一步探討共培養(yǎng)后BMSCs TNF-α表達(dá)的變化情況，以明確TNF-α與BMSCs生物學(xué)特性改變之間的關(guān)系，進(jìn)而為BMSCs臨床安全應(yīng)用奠定理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 30只清潔級(jí)SD雄性大鼠，3～4周齡，體重30～50g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、TrypLE Express細(xì)胞消化液購自美國Gibco公司，0.4μm Transwell小室購自美國Millipore公司，大鼠TNF-α ELISA試劑盒購自中國四正柏公司，快速RNA提取試劑盒購自中國百泰克公司，反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自中國ATGene公司，PI染液、CD90購自美國BD公司，CD29購自美國Biolegend公司，CD34、CD45購自美國Origene公司，c-Myc、NF-κB/P65、CyclinD1抗體購自英國Abcam公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞獲取、鑒定 分離大鼠的股骨和脛骨，用無血清培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，1000r/min離心5min，10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸以獲取大鼠BMSCs。48h后換液，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代，當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí)備用。取第3代BMSCs，向其中加入CD90、CD29、CD34、CD45抗體(1:100)，室溫避光孵育30min，同時(shí)設(shè)立同型陰性對(duì)照。PBS洗2次去除殘余抗體后，采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) BMSCs、C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。BMSCs間接共培養(yǎng)模型的建立采用0.4μm懸掛式小室結(jié)合6孔板的方式，培養(yǎng)至第3代的BMSCs以1×105/ml的密度鋪入6孔板，過夜后插入Transwell小室，小室上鋪入C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，兩種細(xì)胞的比例調(diào)整為1:1，每天換液，共培養(yǎng)7d。

1.2.3 ELISA檢測BMSCs及共培養(yǎng)細(xì)胞上清中游離TNF-α的表達(dá) 當(dāng)細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，24h后收取細(xì)胞上清，1000r/min離心10min，保存至–80℃?zhèn)溆?。向包被孔中加?00μl上清，37℃孵育90min；洗板4次后，加入100μl生物素化抗體，37℃孵育60min；同樣洗板4次后，加入100μl酶標(biāo)結(jié)合物，37℃孵育30min；再次洗板后加入100μl顯色劑，37℃孵育15min，加入100μl終止液，于酶標(biāo)儀上讀取450nm吸光度(OD)值，然后將OD值進(jìn)一步換算成相應(yīng)上清中TNF-α的表達(dá)濃度。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 細(xì)胞分組及形態(tài)觀察 在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的TNF-α。實(shí)驗(yàn)分為4組：BMSCs組、共培養(yǎng)組、共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組、共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組。采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，拍照，觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 CCK8法檢測細(xì)胞活力 取各組對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，消化離心重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104/ml，種入96孔板，共設(shè)置5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每天給對(duì)應(yīng)孔中更換10% CCK8工作液，換液后放入孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后于酶標(biāo)儀上讀取450nm處OD值。根據(jù)每天OD值的變化繪制相應(yīng)的活力曲線。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 各組細(xì)胞消化后離心重懸，PBS洗2次，棄上清，70%的乙醇4℃固定過夜，PBS洗2次去除乙醇，37℃孵育30min，10μl RNase37℃孵育20min，PI染液染色后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.7 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力 Transwell上室加入200μl細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)的無血清培養(yǎng)基細(xì)胞懸液，下室加入500μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24h，擦拭掉上室的細(xì)胞，100%濃度甲醇固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察5個(gè)視野的細(xì)胞遷移數(shù)。

1.2.8 Real-time PCR檢測各組細(xì)胞c-Myc、CyclinD1 mRNA的表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說明書的操作步驟提取各組細(xì)胞的RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為DNA，以其為模板進(jìn)行下一步qPCR的擴(kuò)增。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，β-actin為內(nèi)參照，通過2–ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：c-Myc，正義5'-TGGAACGTCAGAGGAGAAACGA-3'，反義5'-CTTGAACGGACAGGAT GTAGGC-3'；CyclinD1，正義5'-GCATCTACACTGACAACTCTATC-3'，反義5'-TTGTTC TCATCCGCCTCTG-3'；β-actin，正義5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3'，反義5'-GGGG TGTTGAAGGTCTCAAA-3'。

1.2.9 Western blotting檢測NF-κB/P65、CyclinD1、c-Myc蛋白表達(dá)水平 將各組細(xì)胞消化離心，PBS清洗2次后加入適量的蛋白裂解液(裂解液:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑:PMSF=1000:1:10:5)，冰上裂解10min左右，然后160W功率的低檔超聲5min，14 000r/min離心15min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，以蛋白﹕SDS=4:1比例加入SDS上樣緩沖液，煮沸3～5min使其變性，–80℃保存?zhèn)溆?。蛋白上樣量?0μg，經(jīng)電泳后濕轉(zhuǎn)入PVDF膜，5% BSA室溫封閉2h，一抗[NF-κB/P65(1:2000)、CyclinD1(1:1000)、c-Myc(1:8000)、GAPDH(1:5000)]4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 1:3000)室溫孵育1h，TBST再次洗膜，采用凝膠成像發(fā)光系統(tǒng)顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，BMSCs與共培養(yǎng)細(xì)胞上清中TNF-α表達(dá)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；其余多組間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs表面標(biāo)志物的鑒定 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD90表達(dá)率為99.6%，CD29表達(dá)率為100.0%，CD45表達(dá)率為0.1%，CD34表達(dá)率為1.7%(圖1)。本實(shí)驗(yàn)提取細(xì)胞的CD29、CD90呈陽性表達(dá)，CD34、CD45呈陰性表達(dá)，表明該細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞，可用于后續(xù)研究。

圖1 BMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)Fig.1 Expressions of the surface marker of BMSCs

2.2 細(xì)胞上清中游離TNF-α的表達(dá) BMSCs細(xì)胞上清中游離TNF-α的表達(dá)量為(467.90±150.98)pg/ml，共培養(yǎng)細(xì)胞上清中游離TNF-α表達(dá)量為(162.45±31.82)pg/ml，共培養(yǎng)細(xì)胞上清中TNF-α表達(dá)量明顯低于BMSCs細(xì)胞上清(P＜0.05)。

2.3 各組細(xì)胞的形態(tài)特征 倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)，BMSCs組細(xì)胞排列整齊、成纖維狀樣生長、胞質(zhì)豐富；共培養(yǎng)組的BMSCs細(xì)胞體積變小、形態(tài)細(xì)長、核質(zhì)比增大；共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組細(xì)胞排列紊亂，集落樣生長；共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組細(xì)胞形態(tài)與BMSCs組基本一致，但凋亡細(xì)胞增多(圖2)。

圖2 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.2 Morphology of each group of cells (Inverted microscopy,×100)

2.4 各組細(xì)胞增殖能力的變化 CCK8檢測結(jié)果顯示，自第2天開始，共培養(yǎng)組增殖能力即明顯高于BMSCs組(P＜0.05)，而共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組的增殖能力與共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組及共培養(yǎng)組比較明顯降低(P＜0.05，圖3)。

圖3 CCK8法檢測各組生長速率的變化Fig.3 Cell proliferation of each group detected by CCK8

2.5 各組細(xì)胞周期的改變 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組中G2+S期比例明顯高于BMSCs組(P＜0.05)，共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組G2+S期比例與共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組及共培養(yǎng)組比較明顯降低(P＜0.05，表1)。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期時(shí)相的變化(±s，n=3)Tab.1 Distribution of cell cycle phase of each group detected by flow cytometry (±s, n=3)

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期時(shí)相的變化(±s，n=3)Tab.1 Distribution of cell cycle phase of each group detected by flow cytometry (±s, n=3)

(1)P＜0.05 compared with BMSCs; (2)P＜0.05 compared with co-cultured MSCs; (3)P＜0.05 compared with co-cultured MSCs+0.5ng/ml TNF-α

Cell cycle BMSCs Co-cultured MSCs Co-cultured MSCs +0.5ng/ml TNF-α Co-cultured MSCs +5ng/ml TNF-α G1 82.81±7.53 67.23±5.58(1) 74.95±1.57 86.67±1.80(2)(3)G2+S 17.19±7.53 32.77±5.58(1) 25.05±1.57 13.32±1.80(2)(3)

2.6 各組細(xì)胞遷移能力的變化 Transwell檢測結(jié)果顯示，BMSCs組細(xì)胞遷移數(shù)為21.67±3.79，共培養(yǎng)組細(xì)胞遷移數(shù)為66.33±6.03，共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組細(xì)胞遷移數(shù)為59.00±3.61，共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組細(xì)胞遷移數(shù)為20.67±5.13，共培養(yǎng)組細(xì)胞遷移能力高于BMSCs組(P＜0.05)，而共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組細(xì)胞遷移能力與共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組及共培養(yǎng)組比較明顯降低(P＜0.05，圖4)。

圖4 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力改變(×100)Fig.4 Migration ability of each group detected by Transwell

2.7 各組CyclinD1、c-Myc mRNA的表達(dá) Realtime PCR檢測結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組中CyclinD1、c-Myc mRNA的表達(dá)高于BMSCs組(P＜0.05)。而共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組CyclinD1、c-Myc mRNA表達(dá)水平與共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組及共培養(yǎng)組比較均明顯降低(P＜0.05，圖5)。

圖5 Real-time PCR檢測c-Myc、CyclinD1 mRNA的表達(dá)Fig.5 The mRNA expressions of c-Myc and CyclinD1 (Real-time PCR)

2.8 各組NF-κB/P65、CyclinD1、c-Myc蛋白的表達(dá) Western blotting檢測結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組中NFκB/P65、CyclinD1、c-Myc蛋白的表達(dá)高于BMSCs組(P＜0.05)。而共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組NF-κB/P65、CyclinD1、c-Myc蛋白表達(dá)與共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組及共培養(yǎng)組比較均明顯降低(P＜0.05，圖6)。

圖6 Western blotting檢測各組c-Myc、NF-κB/P65、CyclinD1蛋白的表達(dá)Fig.6 Protein expressions of c-Myc, NF-κB/P65 and CyclinD1 (Western blotting)

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、平均生存率低，而傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、放療、化療未能達(dá)到滿意治療效果，尋找更為有效的治療方法迫在眉睫[8]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫源性、易于體外擴(kuò)增，并能作為載體攜帶化療藥物、細(xì)胞因子、溶瘤病毒等生物活性成分對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向治療而成為當(dāng)前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[1]。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤治療中存在風(fēng)險(xiǎn)，長期體外培養(yǎng)、基因編輯、進(jìn)入體內(nèi)受微環(huán)境復(fù)雜因素的影響等均可使間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變[9]。課題組前期研究結(jié)果表明，BMSCs在C6腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境中可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[10]，可能的機(jī)制涉及白介素-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3，IL-6/STAT3)、NF-κB、S100B/晚期糖基化終產(chǎn)物受體(S100B/the receptor of advanced glycation end products，S100B/RAGE)等的表達(dá)升高[11-13]，那么此過程是否還有其他相關(guān)因素參與，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

TNF-α是由巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生的促炎因子，其對(duì)腫瘤的作用具備雙向性，既擁有抗瘤能力也具備促瘤特性，濃度至關(guān)重要，高濃度TNF-α可選擇性破壞腫瘤血管系統(tǒng)、產(chǎn)生特異性T細(xì)胞而發(fā)揮抗瘤效應(yīng)，而低濃度TNF-α與受體結(jié)合，可活化NF-κB信號(hào)通路[6-7]。NF-κB信號(hào)通路的高表達(dá)及活化能促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[14]，同時(shí)，活化的NF-κB能進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引發(fā)STAT3磷酸化，STAT3的表達(dá)升高與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-17]。在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本研究從TNF-α的角度出發(fā)，探討不同濃度狀態(tài)下的TNF-α對(duì)腫瘤微環(huán)境中BMSCs生物學(xué)特性的影響。

Ganapathi等[18]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中TNF-α DNA甲基化水平的升高導(dǎo)致TNF-α分泌降低，低表達(dá)的TNF-α使得腫瘤細(xì)胞惡性程度增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)后BMSCs TNF-α表達(dá)明顯降低，因此我們推測低表達(dá)的TNF-α可能是引發(fā)BMSCs惡性轉(zhuǎn)化的重要因素。故筆者在間接共培養(yǎng)基礎(chǔ)上分別加入高低濃度的TNF-α，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與共培養(yǎng)組、共培養(yǎng)+0.5ng/ml TNF-α組相比，共培養(yǎng)+5ng/ml TNF-α組細(xì)胞生長速度減慢、G2+S期比例降低、遷移能力降低，NF-κB、CyclinD1、c-Myc等的表達(dá)均明顯降低。生長速度快、G2+S期比例低、遷移能力強(qiáng)等均為腫瘤細(xì)胞較為重要的生物學(xué)特性[19]，而CyclinD1是由CCND1基因編碼的蛋白，是細(xì)胞周期中的一個(gè)重要啟動(dòng)子，在腫瘤中多高表達(dá)[20]。c-Myc原癌基因的激活與大多數(shù)腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、分化等過程[21]。共培養(yǎng)組中加入較高濃度的TNF-α對(duì)維持BMSCs生物學(xué)特性的穩(wěn)定有重要作用。因此筆者認(rèn)為，共培養(yǎng)后BMSCs TNF-α的表達(dá)降低可能會(huì)誘導(dǎo)NF-κB表達(dá)增加，進(jìn)而引發(fā)下游增殖、周期等相關(guān)蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致BMSCs產(chǎn)生腫瘤相關(guān)生物學(xué)行為。

綜上所述，C6腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境能使BMSCs產(chǎn)生部分腫瘤相關(guān)生物學(xué)特性改變，共培養(yǎng)后BMSCs中TNF-α表達(dá)降低可能是導(dǎo)致上述改變的重要因素，而維持適宜濃度的TNF-α對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞起保護(hù)作用。本研究為間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床安全應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。