姜黃素對(duì)活化肝星狀細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平的影響及其機(jī)制

韓曉群，林劍國(guó)，楊婧

肝纖維化是因膠原纖維生成和溶解失衡造成的大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積在肝臟內(nèi)形成瘢痕組織的過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要事件。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功能，并具有抗纖維化作用，目前對(duì)HSCs機(jī)制的研究主要集中在抑制HSCs增殖、誘導(dǎo)HSCs凋亡等方面[1-3]。本研究聚焦于姜黃素能否通過調(diào)節(jié)HSCs脂質(zhì)水平抑制HSCs活化，從而發(fā)揮其抗纖維化作用機(jī)制，希望通過探討姜黃素對(duì)活化HSCs脂質(zhì)水平的影響及其可能機(jī)制，為臨床抗纖維化治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 姜黃素、油紅O染色試劑盒、TRI試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甘油三酯(triglyceride，TG)和游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)ELISA試劑盒購(gòu)于中生北控生物科技有限公司；高效RNA-cDNA 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司；2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)于上海欣百諾公司。

1.2 小鼠HSCs的分離、鑒定、培養(yǎng)及藥物干預(yù)C57/B6小鼠購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。向小鼠門靜脈灌注鏈霉蛋白酶和膠原酶，采用梯度離心法分離HSCs。將分離所得HSCs以含20%胎牛血清(FBS)的DMEM懸浮，臺(tái)盼藍(lán)法計(jì)算細(xì)胞數(shù)及存活率。在倒置顯微鏡下觀察，新分離的HSCs在培養(yǎng)液中懸浮，呈球形，折光性強(qiáng)。熒光顯微鏡下觀察，新分離的HSCs在328nm紫外光激發(fā)下發(fā)出藍(lán)綠色的自發(fā)熒光。細(xì)胞以1×106/cm2密度接種于6孔培養(yǎng)板，48h后純度大于95%；3d后以含10% FBS的DMEM常規(guī)傳代培養(yǎng)。取第4～9代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。同時(shí)常規(guī)培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞AML12，作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)前以不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)HSCs或AML12細(xì)胞24h后，再采用凋亡抑制因子存活素(survivin，1nmol/L)預(yù)處理細(xì)胞24h，之后分別以濃度為5、10、20μmol/L姜黃素干預(yù)細(xì)胞24h。

1.3 HSCs內(nèi)脂滴的觀察 采用油紅O染色法。將油紅O溶于60%異丙醇，以4%甲醛固定細(xì)胞15min，加入油紅O溶液染色10min，60%異丙醇漂洗2min除去多余染料，蘇木素復(fù)染，40倍顯微鏡下觀察HSCs內(nèi)脂滴。靜止?fàn)顟B(tài)下HSCs內(nèi)脂滴油紅O染色呈暗紅色。

1.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG和FFA含量 按照TG或FFA檢測(cè)試劑盒說明書，采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的TG和FFA含量。

1.5 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè) 采用RTqPCR檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。使用TRI試劑提取HSCs細(xì)胞總RNA，用高效RNA-cDNA 試劑盒合成第一條互補(bǔ)DNA鏈；用2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)、自水解酶域包含蛋白5(abhydrolase domain containing 5，abhd5)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)的mRNA水平。引物序列如表1所示。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2–ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences in real-time PCR

1.6 脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blotting檢測(cè)收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，按常規(guī)操作進(jìn)行SREBP1c、FAS、abdh5、ATGL的Western blotting檢測(cè)，蛋白條帶通過化學(xué)發(fā)光顯影，目標(biāo)蛋白表達(dá)量通過β-actin進(jìn)行校正。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用Oneway ANOVA分析，進(jìn)一步兩兩比較采用post hoc檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)HSCs內(nèi)脂滴的影響 以5、10、20μmol/L姜黃素干預(yù)活化HSCs和AML12細(xì)胞后，鏡下可見隨著姜黃素濃度增加，HSCs內(nèi)暗紅色脂滴數(shù)量逐漸增多，表明姜黃素可恢復(fù)小鼠HSCs內(nèi)脂滴水平，作用呈劑量依賴性；而姜黃素對(duì)AML12細(xì)胞內(nèi)脂滴無明顯影響(圖1)。

圖1 姜黃素對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)脂滴水平的影響(×40)Fig.1 Effect of curcumin on HSCs' lipid droplet levels (×40)

2.2 姜黃素對(duì)小鼠HSCs脂質(zhì)水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，采用5、10、20μmol/L濃度姜黃素干預(yù)細(xì)胞后，小鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)TG含量[分別為(1.495±0.230)nmol/mg protein、(3.758±0.717)nmol/mg protein、(4.490±0.360)nmol/mg protein]與對(duì)照組[(1.176±0.343)nmol/mg protein]比較明顯升高(P＜0.01)；FFA含量[分別為(57.250±1.463)nmol/mg protein、(78.425±1.030)nmol/mg protein、(111.150±2.350)nmol/mg protein]與對(duì)照組[(28.750±2.433)nmol/mg protein]比較明顯升高(P＜0.01)，且作用呈劑量依賴性。使用凋亡抑制因子survivin抑制細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞內(nèi)TG和FFA含量與未使用survinvin時(shí)比較無明顯變化(圖2)。

圖2 姜黃素對(duì)肝星狀細(xì)胞甘油三酯和游離脂肪酸的影響(n=3)Fig.2 Effects of curcumin on TG and FFA levels in HSCs (n=3)

2.3 姜黃素對(duì)小鼠肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響 RT-qPCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，姜黃素明顯上調(diào)了FAS和SREBP-1c基因的mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，明顯下調(diào)了ATGL基因及蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，但對(duì)abhd5基因表達(dá)無明顯影響(P＞0.05，圖3)。

圖3 姜黃素對(duì)肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1C、FAS、ATGL、abhd5表達(dá)的影響(n=3)Fig.3 Effects of curcumin on the expression of genes related to the lipid metabolism of activated HSCs (n=3)

3 討 論

研究表明，盡管不同原因?qū)е碌母闻K疾病表現(xiàn)出不同的病理變化，但HSCs活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要事件和共同途徑，是肝纖維化的細(xì)胞基礎(chǔ)。HSCs胞質(zhì)內(nèi)的脂滴并非細(xì)胞內(nèi)一個(gè)簡(jiǎn)單的能量貯存器，而是一個(gè)復(fù)雜、活動(dòng)旺盛、動(dòng)態(tài)變化的多功能細(xì)胞器，它參與了脂類代謝與存儲(chǔ)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解，以及某些信號(hào)傳導(dǎo)。多種代謝性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾病及糖尿病，往往都伴隨著脂滴的異常[4]。肝臟損傷過程中，靜止的HSCs發(fā)生明顯的表型變化，包括細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的重新表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積等，這一過程即為HSCs活化。激活的HSCs通過增生和分泌過多的細(xì)胞外基質(zhì)引起肝纖維化的形成。鑒于此，從抑制HSCs活性入手來減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生已成為目前治療肝纖維化的研究熱點(diǎn)[5]。HSCs脂滴消失是細(xì)胞活化的特征之一，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集能夠有效抑制HSCs的活化[6]。

細(xì)胞脂滴內(nèi)脂肪的來源除從細(xì)胞外攝入與轉(zhuǎn)運(yùn)外，主要依賴內(nèi)源性的脂肪合成。肝臟脂肪生成在轉(zhuǎn)錄水平受到一系列調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控，這些調(diào)節(jié)蛋白包括SREBP-1c、過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)等。SREBP-1是SREBP家族成員之一，SREBP-1有兩種亞型，即SREBP-1a和SREBP-1c；在肝臟中SREBP-1a和SREBP-1c的mRNA表達(dá)比例為1:9，在HSCs中其比例為1:4；SREBP-1a主要促進(jìn)脂肪酸和膽固醇的合成，而SREBP-1c則在甘油三酯和磷脂形成中發(fā)揮重要作用[7]。有研究表明，地骨皮甲素能夠通過下調(diào)SREBP-1c 的表達(dá)而抑制脂肪肝的形成[8]；而Lee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1能夠調(diào)節(jié)FAS、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(stearyl coenzyme A desaturase -1，SCD-1)、乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1)等促進(jìn)FFA及TG合成的基因表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)HSCs脂滴堆積的作用。

另外，脂質(zhì)分解在維持脂質(zhì)平衡方面的作用亦不容忽視。脂質(zhì)分解受ATGL、激素敏感性脂肪酶及單?；视王ッ刚{(diào)節(jié)，其中ATGL是脂肪分解的限速酶。AGTL活化須與abhd5相關(guān)聯(lián)活化后才能發(fā)揮催化作用。abhd5是ATGL的輔助活化因子，協(xié)助ATGL催化TG分解生成甘油二酯和FFA[10]。ATGL和abdh5之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系被打破，或任何一方發(fā)生突變都會(huì)影響ATGL的活性，從而導(dǎo)致異位脂質(zhì)堆積。

在正常肝組織內(nèi)，HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞內(nèi)存在大量脂滴；而在纖維化過程中，HSCs激活，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失[6,11]。有研究表明，激活的HSCs內(nèi)恢復(fù)脂滴形成后，細(xì)胞就會(huì)返回到靜止?fàn)顟B(tài)，并明顯抑制產(chǎn)生膠原蛋白的能力[12]。

本研究采用不同濃度的姜黃素對(duì)HSCs進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，姜黃素呈劑量依賴地增加了HSCs內(nèi)脂滴形成及脂肪水平，但對(duì)肝細(xì)胞AML12內(nèi)脂肪水平?jīng)]有影響，說明姜黃素只對(duì)HSCs起作用；進(jìn)一步針對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)分子的研究表明，姜黃素通過增加脂肪的合成及抑制脂肪的分解來達(dá)到積累脂肪的目的。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素在一定濃度下可抑制HSCs的增殖，并促進(jìn)其凋亡。為證實(shí)HSCs細(xì)胞內(nèi)脂滴的變化不是HSCs促進(jìn)凋亡的結(jié)果，本研究采用凋亡抑制因子survivin(1nmol/L)處理細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)姜黃素的作用受到明顯影響，表明恢復(fù)HSCs脂質(zhì)水平可能是姜黃素抑制HSCs活化的機(jī)制之一。

另有研究證實(shí)，姜黃素可通過調(diào)節(jié)瘦素及瘦素受體表達(dá)而在抗肝臟脂肪變性及抗肝纖維化中發(fā)揮作用[13-14]，但其通過調(diào)節(jié)HSCs內(nèi)脂滴水平發(fā)揮抗纖維化的作用是否與瘦素受體相關(guān)，尚須進(jìn)一步研究。

綜上所述，姜黃素可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)HSCs脂滴堆積，且對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂滴水平無明顯影響，提示姜黃素在肝纖維化的治療中具有一定的應(yīng)用潛力。