多孔絲素顆粒的可控制備及藥物負載研究

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(浙江理工大學材料與紡織學院，杭州 310018)

0 引 言

近年來癌癥的發(fā)病率和死亡率越來越高，抗癌藥物能有效殺死癌細胞,但藥物在血液環(huán)境中易被降解而無法在人體內穩(wěn)定存在，為維持藥物在體內的有效血藥濃度，研究者們設計了將藥物包覆在載體之上的載藥體系[1-2]。當載體包覆藥物后，藥物能穩(wěn)定存在于血液環(huán)境中，從而達到增強藥物穩(wěn)定性的效果。此外，載體還能在一定刺激條件下，對藥物進行可控釋放，因此研究一種抗癌藥物的高效載體非常重要。

藥物載體材料的類型主要有無機材料[3-4]和有機高分子材料[5-6]，但無機材料在體內釋放藥物后難降解，絲蛋白質作為一種天然高分子材料，生物相容性良好，能被蛋白酶水解[7]，可作為藥物載體材料來解決在體內降解困難的問題。同時，絲蛋白制備的纖維和膜具有一定的機械強度，應用在手術縫紉線、人造血管及醫(yī)用敷料[8-11]等研究方面。Kundu等[12]采用去溶劑化的方法制備絲素納米顆粒，結果顯示絲素納米球呈β-折疊結構，且無明顯細胞毒性。Wenk等[13]人以水楊酸為藥物模型，制得絲素蛋白載藥微囊，發(fā)現(xiàn)由濃度高的絲素蛋白溶液制備的載藥微囊，對藥物的釋放速率更穩(wěn)定。

本實驗以絲蛋白為載體材料，阿霉素為抗腫瘤藥物模型，制備粒徑可控的微納米顆粒。在顆粒形成過程中，絲素顆粒將藥物阿霉素包覆在其中，從而實現(xiàn)對藥物阿霉素的負載；并在不同pH的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，測定阿霉素的釋放速率和累積釋放量，對載藥微球響應釋放阿霉素的性能進行表征。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

蠶繭購自湖州新天絲生物技術有限公司，溴化鋰、碳酸鈉購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，無水磷酸氫二鈉和無水磷酸二氫鈉購自天津市科密歐化學試劑有限公司，阿霉素購自上海士鋒生物科技有限公司。

1.2 絲素溶液的制備

將蠶繭加入0.02 mol/L的碳酸鈉溶液中煮沸30 min，重復兩次，用超純水洗滌3次，于60 ℃烘箱中干燥過夜。稱取15 mg脫膠后的絲素纖維，溶解在100 mL濃度為9.30 mol/L的溴化鋰溶液中，60 ℃反應2 h。將溶解得到的絲素溶液置于透析袋中，去離子水透析3 d，每12 h更換去離子水，對所得溶液進行離心即得到絲素溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 絲素微納米顆粒的制備及藥物負載

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值為8、濃度為1.25 mol/L的磷酸鹽溶液，將濃度分別為0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL的絲素溶液緩慢滴加到磷酸鹽溶液中，低溫處理4 h后再在20 ℃熟化溫度下處理12 h，離心去離子水洗滌三次，得多孔的絲素微納米顆粒(silk fibroin nanoparticle,SFNPs)。選擇最優(yōu)的絲素溶液濃度作為下一步研究的工藝條件。

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值為8濃度分別為1.00、1.25、1.50、2.00 mol/L磷酸鹽溶液，將濃度為最優(yōu)的絲素溶液緩慢滴加到其中，低溫處理4 h后再在熟化溫度下處理12 h，離心洗滌三次，得到SFNPs。選擇最優(yōu)的磷酸鹽溶液濃度作為下一步研究的工藝條件。

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值為8濃度為最優(yōu)濃度的磷酸鹽溶液，將濃度為最優(yōu)的絲素溶液緩慢滴加到其中，低溫處理4 h后再在不同熟化溫度(10、20、30、40 ℃)下處理12 h，離心洗滌三次，得到SFNPs。選擇最優(yōu)的熟化溫度作為下一步研究的工藝條件。

選取上述實驗最優(yōu)工藝條件，將阿霉素加入到絲素溶液中，混合均勻后，將絲素溶液加入到磷酸鹽溶液中，低溫處理4 h后熟化溫度下處理12 h，離心洗滌，得到載藥絲素顆粒。

1.4 載藥顆粒對藥物的體外緩釋

將制備的載藥顆粒分散于pH為5.0、6.5、7.4的PBS中，放入37 ℃恒溫振蕩箱中，振蕩頻率150 r/min，分別隔1.0、2.5、4.5、7.0、10.5、14.0、19.0、25.0、32.0 h檢測阿霉素釋放量。

1.5 表征分析

采用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM，日本Hitachi公司 S-4800型)觀察多孔絲素顆粒的表面形貌。

采用馬爾文激光粒度儀(Zetasizer，英國馬爾文儀器有限公司NanoZS90型)測定絲素顆粒的粒徑、粒徑分布及顆粒表面電位。

采用傅里葉紅外變換衰減全反射紅外吸收光譜儀(FTIR，美國Thermo Electron)對絲素蛋白在形成顆粒前后進行結構分析。

采用紫外分光光度計測定阿霉素的在480 nm處的吸光度，建立標準曲線，對絲素顆粒包覆藥物的載藥量和包封率[14]進行定量計算。計算公式如下：

2 結果與討論

2.1 絲素濃度對SFNPs形貌及粒徑的影響

絲素溶液濃度會影響晶體生長，為了解絲素溶液濃度對SFNPs形貌及粒徑分布的影響，在SFNPs制備過程中保持熟化溫度為20 ℃，磷酸鹽溶液濃度為1.25 mol/L不變，僅改變絲素溶液濃度，分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。采用掃描電鏡和激光粒度儀對SFNPs的形貌和粒徑分布進行表征，結果如圖1所示。圖1(a)中絲素濃度為0.5 mg/mL時，絲素顆粒表面為多孔結構，圖1(e)中絲素顆粒的粒徑最小，主要分布在500～600 nm左右，顆粒為表面呈多孔結構的球形。圖1(d)在絲素濃度增加到2.0 mg/mL時，絲素顆粒表面多孔結構沒有變化，圖1(h)粒徑增大到1500 nm左右。從圖1的掃描電鏡照片看出隨著絲素溶液濃度增加，SFNPs的多孔結構幾乎沒有發(fā)生變化，顆粒粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，激光粒度儀結果如圖1(e)-(h)，隨著絲素溶液濃度增加，絲素顆粒粒徑增加，也證實掃描電鏡觀察到的結果。其原因可能是在制備絲素顆粒的過程中，絲素溶液濃度越高，越易于析出，析出的絲素小顆粒作為晶種使溶液中的絲素蛋白能夠在其上生長，形成大的絲素顆粒[15]。圖1中絲素溶液濃度0.5 mg/mL和1.0 mg/mL相比，后者顆粒粒徑稍有增加，粒徑分布變化不大，考慮到產(chǎn)量的問題，這里選擇濃度為1.0 mg/mL。

2.2 熟化溫度對SFNPs形貌及粒徑的影響

溫度會影響晶體生長，為探究熟化溫度對絲素形貌及粒徑分布的影響，在絲素溶液濃度為1 mg/mL，磷酸鹽濃度為1.25 mol/L的工藝條件下，分別在不同熟化溫度下制備SFNPs，采用掃描電子顯微鏡及激光粒度儀對SFNPs進行表征。圖2(a)中熟化溫度為10 ℃時，絲素顆粒主要呈球形，少部分為短棒狀，表面呈多孔結構，圖2(e)粒徑主要分布在2000～2300 nm左右。圖2(d)當熟化溫度升高到40 ℃時，跟圖2(a)相比，更多顆粒呈球形，表面多孔結構沒有變化，且粒徑減小，減少到1500～1700 nm。從圖2的掃描電鏡圖中看出，絲素顆粒形貌變化不大，隨著熟化溫度的增加，絲素顆粒粒徑呈現(xiàn)減小的趨勢。激光粒度儀結果表明熟化溫度越高，絲素顆粒粒徑越小，而且粒徑分布范圍更窄。這是由于晶核在低溫條件下生長速度快，高溫會破壞已形成的有序晶核，特別是在均相成核中，因而隨著熟化溫度升高，絲素顆粒粒徑減小[16]?？紤]到粒徑小有利于細胞吞噬，因此選熟化溫度為40 ℃。

圖1 不同絲素溶液濃度的SFNPs掃描電鏡照片和的粒徑分布

圖2 不同熟化溫度的絲素顆粒掃描電鏡照片及其粒徑分布

2.3 離子強度對SFNPs形貌及粒徑的影響

蛋白質是親水性大分子，在水溶液中有雙電層結構，以保證分子的溶解度平衡并在水溶液中穩(wěn)定存在。當加入無機鹽類時，鹽會電離成為離子態(tài)，鹽離子的電性破壞溶液中蛋白質的雙電層結構，從而導致蛋白質沉淀析出[17]。不同離子強度對蛋白質雙電層的影響程度不同，為探究不同離子強度對絲素顆粒及粒徑分布，在絲素溶液濃度為1 mg/mL，熟化溫度為40 ℃工藝條件下，采用掃描電鏡和激光粒度儀對絲素顆粒形貌及粒徑分布進行表征。圖3(a)離子強度為1.00 mol/L時，顆粒表面呈多孔結構，圖3(e)粒徑主要分布在950 nm左右。當離子強度增加到2.00 mol/L時，如圖3(d)所示，顆粒表面多孔結構減少，圖3(h)粒徑主要集中在500 nm左右，且粒徑分布范圍更窄。圖3掃描電鏡結果顯示，隨著離子強度增加，絲素表面形貌更加趨向平滑，粒徑分布呈減小的趨勢，激光粒度儀結果如圖3(e)-(h)，隨著離子強度增加，絲素顆粒粒徑減小，也證實掃描電鏡中粒徑減小的現(xiàn)象。

為證實離子強度影響絲素蛋白的雙電層結構，測定不同離子強度制得的絲素顆粒的表面電位。圖4結果表明，當離子強度為1.00 mol/L時，顆粒表面電位為-35 mV，當離子強度增加到2.00 mol/L時，顆粒表面電位增加-47 mV左右，這表明隨著離子強度的增加，絲素顆粒的表面電位也增加，這一結果跟前面圖3分析得到的隨著離子強度增加，顆粒粒徑減小的結果一致，即離子強度越高，對蛋白質雙電層影響程度越大，高的表面電位有利于顆粒在溶液體系中穩(wěn)定存在，在制備藥物載體時選用離子強度為2.00 mol/L的鹽浴溶液。

圖3 不同離子強度的絲素顆粒掃描電鏡照片及粒徑分布

圖4 不同離子強度制得的絲素顆粒的Zeta電位

2.4 SF鹽析前后構象的變化

將新制的絲素蛋白溶液通過冷凍干燥，得再生絲素蛋白(regenerated silk fibroin，RSF)，RSF、SFNPs的紅外光譜圖如圖5所示。再生絲素蛋白在形成微納米顆粒后，RSF的酰胺Ⅰ峰(C=O伸縮振動)的位置從原來的1633.22 cm-1移到了1655.14 cm-1[18]，表明絲素鹽析后的構象趨向于形成無規(guī)線團，說明高濃度的鹽溶液不利于了絲素纖維的有序排列。SFNPs在1540.86 cm-1處的酰胺Ⅱ(N-H彎曲振動)和1239.43 cm-1處的酰胺Ⅲ(C-N伸縮振動)峰值明顯增加，也說明絲素蛋白顆粒大部分為無規(guī)線團結構和少量α-螺旋結構。

圖5 絲素蛋白鹽析前后紅外譜圖

2.5 SFNPs的藥物負載

將未載藥的純絲素顆粒、載藥的絲素顆粒及藥物阿霉素(DOX)，跟溴化鉀粉末研磨后進行壓片，得到SFNPs、DOX、SFNPs-DOX的紅外光譜圖，結果如圖6所示。

由圖6結果可知，載藥后的絲素顆粒分別在2850.32、1281.90、989.03 cm-1呈現(xiàn)出阿霉素的特征振動峰，表明阿霉素已經(jīng)成功被絲素顆粒包覆在顆粒中。由于SFNPs呈很高的負電性，Zeta電位為-47 mV，阿霉素呈弱正電性，阿霉素通過靜電吸附的方式負載于絲素顆粒上，從而使SFNPs實現(xiàn)對藥物阿霉素的負載。

圖6 載藥絲素顆粒的紅外光譜圖

為實現(xiàn)載體對藥物阿霉素的負載量和包封率的定量計算，通過紫外分光光度計對溶液中未包覆的阿霉素進行測定，結合標準曲線如圖7所示，阿霉素的濃度與吸光度呈線性相關，方程式為Y=0.024X-0.001，曲線擬合度R2為0.99983，計算得載藥量為14.08 μg/mg，包封率為93.86%。表明SFNPs將絕大部分阿霉素負載在其上，實現(xiàn)對抗癌藥物阿霉素的高效負載。

圖7 阿霉素的標準曲線

2.6 藥物的pH響應釋放

由于癌細胞內部環(huán)境的pH值呈弱酸性，pH為5.0的PBS模擬癌細胞中內涵體和溶酶體的微環(huán)境，pH值為6.5的PBS模擬腫瘤細胞外環(huán)境，pH值為7.4的PBS模擬體內血漿環(huán)境[19]。阿霉素是通過靜電吸附的方式負載于絲素顆粒中，不同pH條件會影響其靜電相互作用[20]，根據(jù)環(huán)境pH值的不同實現(xiàn)藥物的響應釋放。

圖8為載藥絲素顆粒在不同pH值的PBS中的累積釋放藥物阿霉素的量隨時間的關系曲線。圖8結果表明，當PBS的pH為7.4時，藥物釋放速率最慢，在釋放7 h后達平衡狀態(tài)，累積釋放量為25.85%。當PBS的pH為6.5時，在釋放14 h后達到平衡，累積釋放量為41.21%。PBS的pH為5.0時藥物的釋放速率在最快，釋放14 h后達平衡期，藥物的總釋放量為68.21%。圖8說明酸性條件有利于藥物釋放。藥物在酸性條件下釋放量的增加，主要是由于酸性環(huán)境削弱了阿霉素和絲素蛋白之間的靜電作用，導致藥物從納米顆粒中釋放出來。以上結果表明絲素制得的納米顆?？勺鳛樗幬镙d體，并在弱酸性環(huán)境的腫瘤細胞內部及周圍實現(xiàn)pH響應釋放。

圖8 載藥絲素顆粒的體外釋放曲線

3 結 論

通過研究絲素溶液的濃度、熟化溫度、磷酸鹽溶液濃度，得到粒徑可控的多孔絲素顆粒。絲素溶液濃度越低，磷酸鹽溶液濃度越高，熟化溫度越高，制得的絲素顆粒粒徑越小。納米級多孔絲素顆粒對抗癌藥物阿霉素的負載性能良好，藥物釋放速率和累積釋放量隨pH降低而增加，根據(jù)癌細胞內部環(huán)境的pH比正常細胞低，可實現(xiàn)藥物的控制釋放，具有可觀的醫(yī)用前景，有望應用于癌癥治療。

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