γ—干擾素釋放試驗、熒光定量PCR、結(jié)核菌素皮膚試驗聯(lián)合檢測對涂陰性肺結(jié)核的診斷價值

李強饒+常紅+黃渤

【摘要】 目的：研究γ-干擾素釋放試驗（IGRA）、熒光定量PCR（FQ-PCR）、結(jié)核菌素皮膚試驗（TST）三種方法聯(lián)合檢測對涂陰性肺結(jié)核的診斷價值。方法：選取確診的33例涂陰性肺結(jié)核和30例非結(jié)核的肺部感染患者，分別使用酶聯(lián)免疫法（ELISA法），測定患者全血干擾素的濃度，熒光定量PCR法檢測患者肺泡灌洗液的結(jié)核桿菌DNA，卡介菌純蛋白衍生物（BCG-PPD）進(jìn)行結(jié)核菌素皮膚試驗。結(jié)果：γ-干擾素釋放試驗、熒光定量PCR、結(jié)核菌素皮膚試驗三種檢測方法在肺結(jié)核組和非肺結(jié)核組的陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；三種檢測方法在肺結(jié)核組的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。γ-干擾素釋放試驗方法的靈敏度為84.85%，特異度為86.67%，Youden指數(shù)為0.72；熒光定量PCR方法的靈敏度為60.61%，特異度為83.33%，Youden指數(shù)為0.44；結(jié)核菌素皮膚試驗的靈敏度為81.82%，特異度為53.33%，Youden指數(shù)為0.35。聯(lián)合檢測試驗中以IGRA平行聯(lián)合FQ-PCR（Youden指數(shù)為0.66）和IGRA系列聯(lián)合TST（Youden指數(shù)為0.63）的診斷效能最好。結(jié)論：γ-干擾素釋放試驗較熒光定量PCR、結(jié)核菌素皮膚試驗對涂陰性肺結(jié)核有更好的診斷價值，聯(lián)合檢測試驗以IGRA平行聯(lián)合FQ-PCR診斷價值最佳。

【關(guān)鍵詞】 干擾素釋放試驗； 熒光定量PCR； 結(jié)核菌素試驗； 涂陰性肺結(jié)核； 診斷價值

【Abstract】 Objective：To study the diagnostic value of the combination of interferon gamma release assay （IGRA），fluorescence quantitative PCR （FQ-PCR） and tuberculin skin test （TST） for the diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis.Method：Thirty-three patients diagnosed smear negative pulmonary tuberculosis and 30 cases of no tuberculosis were detected by using three ways，the IGRA was completed by detecting the patient of concentration of blood interferon with using ELISA；mycobacterium tuberculosis DNA was measured in bronchoalveolar lavage fluid by using fluorescent quantitative PCR；the tuberculin skin test was achieved by using Purified Protein Derivative of BCG （BCG-PPD）.Result：The IGRA，F(xiàn)Q-PCR，TST were significant differences in positive rate of pulmonary tuberculosis group and non tuberculosis group（P<0.05）；and the positive rate of the three detection methods were significant differences in pulmonary tuberculosis group too（P<0.05）.The sensitivity of interferon gamma release assay was 84.85%，the specificity was 86.67%，the Youden index was 0.72；the sensitivity of fluorescence quantitative PCR was 60.61%，the specificity was 83.33%，the Youden index was 0.44；the sensitivity of TST was 81.82%，the specificity was 53.33%，the Youden index was 0.35.The diagnostic efficacy of the IGRA parallel connected FQ-PCR test（its Youden index was 0.66）and the IGRA series connected TST test（its Youden index was 0.63）was better in all connection test.Conclusion：The diagnostic value of interferon gamma release assay is best in the three detection for smear negative pulmonary tuberculosis，and the diagnostic value of IGRA combined in parallel with FQ-PCR is best in all combined detection.

【Key words】 Interferon release assay； Fluorescence quantitative PCR； Tuberculin skin test； Smear negative pulmonary tuberculosis； Diagnostic valueendprint

First-authors address：The Affiliated Hospital of Jiujiang College，Jiujiang 332000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.33.002

我國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病發(fā)病人數(shù)居全球第二位，防治任務(wù)艱巨。對于涂陽性肺結(jié)核的患者，很容易被診斷并能給予及時抗結(jié)核治療，但是臨床上往往存在大量涂陰性肺結(jié)核的患者，因無法及時診斷，導(dǎo)致患者病情延誤，造成不良后果[1-3]。過去使用結(jié)核菌素皮膚試驗是臨床輔助診斷肺結(jié)核的常用方法，但是它的假陽性率較高，導(dǎo)致過度治療[4-7]。近幾年，文獻(xiàn)[8-11]報道，γ-干擾素釋放試驗對診斷肺結(jié)核有較高的敏感性和特異性，但是其鑒別肺結(jié)核潛伏性感染和活動性感染有一定困難。本研究開展了γ-干擾素釋放試驗聯(lián)合肺泡灌洗液熒光定量PCR、結(jié)核菌素皮膚試驗三種檢測手段來評估對涂陰性肺結(jié)核的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2015年1月-2016年9月因肺部感染在本院呼吸科住院患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～75歲；（2）臨床上有咳嗽、咳痰癥狀；（3）胸片或胸部CT提示肺部陰影，考慮肺部感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠婦女；（2）意識障礙、嚴(yán)重高血壓、心律失常、重度心功能不全患者；（3）排除非感染性肺部疾病如肺水腫、肺部腫瘤、肺栓塞、非感染性肺間質(zhì)性疾病、肺血管炎等。入選患者被分為兩組，試驗組即涂陰性肺結(jié)核組，診斷標(biāo)準(zhǔn)是按照中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008年版）[12]，涂陰性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）三次痰涂片陰性，胸部影像學(xué)檢查顯示與活動性肺結(jié)核相符的病變（與原發(fā)性肺結(jié)核、血行播散性肺結(jié)核、繼發(fā)性肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎任一種肺結(jié)核病變影像學(xué)表現(xiàn)相符）且伴有咳嗽、咳痰、咯血等肺結(jié)核可疑癥狀；（2）三次痰涂片陰性，胸部影像學(xué)檢查顯示與活動性肺結(jié)核相符的病變且抗結(jié)核抗體檢查陽性；（3）三次痰涂片陰性，胸部影像學(xué)檢查顯示與活動性肺結(jié)核相符的病變且肺外組織病理檢查證實為結(jié)核病變者；（4）三次痰涂片陰性的疑似肺結(jié)核病例經(jīng)診斷性治療或隨訪觀察可排除其他肺部疾病者；（5）三次痰涂片陰性，纖維支氣管鏡灌洗液檢出抗酸分枝桿菌；（6）三次痰涂片陰性，支氣管或肺部組織病理證實結(jié)核病變；符合上述6條診斷標(biāo)準(zhǔn)中1條即可診斷。試驗組所有病例均隨訪3個月，排除非結(jié)核性感染性肺病，最終獲得確診，共入選33例患者，其中男23例，女10例，平均年齡（45.0±3.2）歲。對照組為非結(jié)核肺部感染組包括社區(qū)獲得性肺炎、肺癌伴阻塞性肺炎、支氣管擴(kuò)張伴感染、慢性阻塞性肺病伴感染，最終入選30例，

其中男20例，女10例，平均年齡（43.0±2.5）歲。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 γ-干擾素釋放試驗儀器采用武漢海吉力生物科技有限公司生產(chǎn)的HGNElisa01型全自動酶聯(lián)免疫工作儀，試劑為武漢海吉力生物科技有限公司研制的結(jié)核桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒，熒光定量PCR法儀器為采用美國Perkin Elmer公司5700全自動PCR分析儀器，試劑采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司PCR檢測試劑盒。結(jié)核菌素皮膚試驗試劑采用卡介菌純蛋白衍生物，為北京祥瑞生物制品有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字S10960019。

1.3 方法

1.3.1 γ-干擾素釋放試驗 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血中γ-干擾素的濃度，具體操作步驟如下：使用BD肝素鋰抗凝采血管抽取入組患者4～5 mL靜脈血，輕柔顛倒混勻20次左右，使抗凝劑充分溶解送本院檢驗科；檢驗者3 h內(nèi)將采集的全血分裝到3種不同的培養(yǎng)管中，“T”管為添加了結(jié)核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測試培養(yǎng)管，“N”管為本底對照培養(yǎng)管，“P”管為添加了非特異刺激原植物凝血素（PHA）的陽性對照培養(yǎng)管，每種培養(yǎng)管分裝1 mL血樣，分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管20次左右，并立刻置于37 ℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)20～24 h后取出，離心收集上清液，然后用采用酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測三種管中血上清液中γ-干擾素的濃度，最后根據(jù)各管檢測的γ-干擾素的濃度來判定是否為結(jié)核桿菌感染陽性。具體結(jié)果判定的參考值如下：（1）N≤8 IU/mL，P-N任何值，T-N≥0.35 IU/mL并且≥N/4，判定為陽性；

（2）N≤8 IU/mL，P-N≥0.5 IU/mL，T-N<0.35 IU/mL

或≥0.35 IU/mL但

1.3.2 熒光定量PCR 入組患者均在本科室常規(guī)行電子支氣管鏡（型號為Pentax3500）檢查，按常規(guī)電子支氣管鏡操作準(zhǔn)備，檢查前均禁食、禁飲4 h，并簽署內(nèi)窺鏡檢查同意書，檢查前給予利多卡因局麻，根據(jù)患者胸部CT資料，在病變肺段行支氣管肺泡灌洗術(shù)，收集肺泡灌洗液約30 mL，立即送本院PCR室，行熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌DNA。檢測采用結(jié)核分支桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒（由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)），熒光定量PCR儀器為美國Perkin Elmer公司5700全自動PCR分析儀，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果分為陽性和陰性。

1.3.3 結(jié)核菌素皮膚試驗 入組患者均在本科住院部由護(hù)士行結(jié)核菌素皮膚試驗，試驗采用卡介菌純蛋白衍生物試劑（北京祥瑞生物制品有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字S10960019），方法如下：使用5 IU結(jié)核菌素試劑在患者左前臂掌側(cè)行皮內(nèi)注射，記錄時間，72 h后觀察結(jié)果；判定標(biāo)準(zhǔn)為：（1）硬結(jié)直徑（d）<5 mm為陰性（-）；（2）硬結(jié)直徑≥5～10 mm為弱陽性（+）；（3）硬結(jié)直徑≥10～20 mm為陽性（++）；（4）硬結(jié)直徑≥20 mm或局部出現(xiàn)水泡、壞死或有淋巴炎，均為強陽性（+++）。陽性和強陽性判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，三種檢測方法陽性率結(jié)果比較，采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；按診斷試驗評價方法計算三種診斷試驗的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、Youden指數(shù)、陽性預(yù)測值。

2 結(jié)果

2.1 兩組三種檢測方法的陽性率比較 肺結(jié)核組的γ-干擾素釋放試驗、熒光定量PCR、結(jié)核菌素試驗的陽性率，與非肺結(jié)核組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 三種檢測方法在肺結(jié)核組的陽性率比較 三種檢測方法在肺結(jié)核組的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ 字2=6.27，P<0.05），見表2。

2.3 三種檢測方法單獨診斷肺結(jié)核的效能評價 三種檢測方法單獨診斷肺結(jié)核的效能評價，見表3。

2.4 三種檢測方法聯(lián)合檢測的診斷效能評價 三種檢測方法聯(lián)合檢測的診斷效能評價結(jié)果，見表4、5。

3 討論

肺結(jié)核在我國發(fā)病率仍然居高不下，2010年全國肺結(jié)核發(fā)病率為78/100 000，據(jù)此估計全國肺結(jié)核患者仍有百萬之多[13]。過去傳統(tǒng)診斷肺結(jié)核是依靠痰涂片抗酸染色檢測結(jié)核分枝桿菌，但是它的陽性率較低，僅有30%～40%，而且不能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌；痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)法是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但長達(dá)4～6周的培養(yǎng)時間，嚴(yán)重影響臨床及時診斷性。況且臨床上常常遇到大量涂陰性肺結(jié)核，診斷往往較為棘手，曾經(jīng)很長一段時間TST是診斷涂陰性肺結(jié)核感染的唯一手段，由于它價格低廉、操作方便，被各級醫(yī)院廣泛使用；但是由于我國廣泛接種卡介苗，TST所用的試劑某些抗原成分與卡介苗及非結(jié)核分枝桿菌的某些抗原成分相同很容易造成假陽性，造成特異度降低，導(dǎo)致誤診。此外TST的細(xì)胞免疫反應(yīng)需要正常免疫反應(yīng)和時間，而老年人、免疫功能低下和免疫缺陷患者易造成假陰性，導(dǎo)致漏診。因此臨床急需要靈敏度和特異度均較高的診斷肺結(jié)核的方法。干擾素釋放試驗是近幾年來發(fā)展起來的用于檢測結(jié)核分枝桿菌感染的新方法，它是利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原即早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培養(yǎng)分泌蛋白10（CFP-10），在體外刺激受檢者全血或外周血單個核細(xì)胞（PBMC），使T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量γ干擾素（IFN-γ），然后用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）檢測IFN-γ濃度或計數(shù)分泌IFN-γ細(xì)胞的方法[14]。這兩種抗原蛋白具有高度特異性，在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中均不存在，因此不會造成假陽性。國外文獻(xiàn)[15]報道其檢測潛伏性結(jié)核感染（LTBI）的敏感性達(dá)70%～80%，特異性達(dá)88%～97%，均高于TST，因此2005年美國FDA已批準(zhǔn)IGRA作為診斷結(jié)核分枝桿菌感染的輔助診斷手段應(yīng)用于臨床。對于活動性肺結(jié)核診斷價值，文獻(xiàn)[1-5]報道其敏感性為76%～90%，特異性為86%～96%，大大高于TST檢查。本研究顯示，IGRA在肺結(jié)核組和非結(jié)核肺部感染組的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），其單獨診斷涂陰性肺結(jié)核的靈敏度為84.85%，特異度為86.67%，與文獻(xiàn)[1-11]報道基本一致，本研究還顯示IGRA的Youden指數(shù)高達(dá)0.72，Youden指數(shù)是綜合了靈敏度和特異度的信息，大量研究表明診斷試驗的Youden指數(shù)若大于0.7，則代表該診斷試驗有較高的診斷價值，因此本文研究提示IGRA對涂陰性肺結(jié)核有較高的診斷價值，與文獻(xiàn)[1-11]研究相符。

FQ-PCR法是目前較為成熟的檢測技術(shù)，具有高靈敏性、高準(zhǔn)確性、高特異性、定量范圍寬、操作簡便、快速安全，已運用臨床十余年。過去由于其易污染、假陽性及不能定量，影響臨床診斷效果，本研究使用熒光定量PCR技術(shù)集PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點為一體，直接探測PCR過程中的熒光變化，獲DNA模板的準(zhǔn)確定量結(jié)果。整個過程在閉管狀態(tài)下進(jìn)行，避免了因污染而導(dǎo)致的假陽性，因此結(jié)果較以往更加準(zhǔn)確、可靠。此外本研究標(biāo)本采用患者肺泡灌洗液，直接從患者肺部病變處獲取標(biāo)本，因此理論上應(yīng)能夠提高診斷陽性率，但本研究顯示此項檢測方法在肺結(jié)核組的陽性率為60.61%，與IGRA陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其靈敏度為60.61%，特異度為83.33%，Youden指數(shù)為0.44，診斷效能不盡如意，與文獻(xiàn)[16-20]報道有所出入，原因考慮本研究肺泡灌洗液取的標(biāo)本相對較少或行肺泡灌洗的肺段部位有時會出現(xiàn)一定誤差，從而導(dǎo)致陽性率和靈敏度下降。TST是較為經(jīng)典、成熟的檢測肺結(jié)核的方法，正如上面所述，TST所用的試劑某些抗原成分與卡介苗及非結(jié)核分枝桿菌的某些抗原成分相同很容易造成假陽性，造成特異度降低，導(dǎo)致特異性較差，本研究顯示TST的靈敏度為81.81%，特異度為53.33%，與文獻(xiàn)[21]報道基本一致。

正如上述所說，IGRA在診斷肺結(jié)核有較高的敏感性和特異性，但是它無法鑒別結(jié)核潛伏性感染還是活動性感染，而FQ-PCR有較好的特異性，TST有較高的靈敏度，三種或兩種方法聯(lián)合檢測是否能產(chǎn)生更高的診斷價值？本研究顯示三種檢測方法并聯(lián)聯(lián)合檢測，Youden指數(shù)僅為0.37，而三種檢測方法串聯(lián)聯(lián)合檢測，Youden指數(shù)也只有0.41，均低于IGRA的單獨檢測的診斷效能。而兩種方法聯(lián)合檢測試驗中，以IGRA平行聯(lián)合FQ-PCR和IGRA系列聯(lián)合TST的的Youden指數(shù)較高，均接近達(dá)到0.7，好于三種方法聯(lián)合檢測的診斷效能。為何出現(xiàn)如此結(jié)果，首先考慮根據(jù)聯(lián)合檢測計算靈敏度和特異度的方法，當(dāng)靈敏度明顯升高時，反而導(dǎo)致特異度顯著下降，而特異度顯著提高時，靈敏度反而明顯下降，最終導(dǎo)致綜合靈敏度和特異度的Youden指數(shù)反而并沒有顯著增加；此外由于本研究時間不長，樣本量偏小，也可能產(chǎn)生一定誤差，因此有待今后加大樣本量進(jìn)一步研究。因此根據(jù)本研究的結(jié)果，三種檢測方法聯(lián)合檢測，并不優(yōu)于兩種方法聯(lián)合檢測，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，臨床上對待診斷較困難的涂陰性肺結(jié)核，IGRA是較好的輔助診斷方法，必要時聯(lián)合PQ-PCR或TST檢測。endprint

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（收稿日期：2017-10-13） （本文編輯：張爽）endprint