警報素既是免疫警報又是疾病警報①

全紫瑤 謝圣高 崔天盆

(武漢市第一醫(yī)院檢驗科，武漢 430022)

病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)是指某些病原體及其產(chǎn)物所共有的高度保守、可被模式識別受體識別結(jié)合的特定分子結(jié)構，如革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)、革蘭陽性菌的磷壁酸、細菌鞭毛蛋白以及細菌DNA等，它們能與免疫細胞表面的模式識別受體(Pattem recognition receptor，PRR)結(jié)合，如糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)等激活相應的信號通路，產(chǎn)生炎癥反應[1]。

1994年，Matzinger等[2]提出一種“危險信號”假說，即免疫系統(tǒng)可能不會進化到具備識別自我和非我的能力，而只能夠感受到“危險”。當機體處于應激狀態(tài)，或受到無菌性創(chuàng)傷和炎癥刺激時，白細胞和上皮細胞釋放內(nèi)源性生物介質(zhì)也稱為危險相關分子模式DAMPs(Danger-associated molecular patterns，DAMPs)，使機體“感受到危險”，并通過趨化和激活抗原遞呈細胞(APC)等免疫細胞增強固有和適應性免疫應答。2005年Oppenheim等[3]將滿足以下三個生物學特征的這些內(nèi)源性分子定義為警報素：①由細胞受到損傷或非程序性死亡，迅速釋放出來，以抵抗感染和組織損傷；②對APC具有趨化和激活作用；促進受損組織的修復和再生[3]。

近年來，有研究者提出，當沒有細胞損傷和死亡，活細胞在受到壓力和生理應激時，也能釋放在細胞內(nèi)外發(fā)揮不同特定功能的蛋白質(zhì)也稱為Alarmins,這種類型的警報素被定義為壓力素(Stressorins)。這些壓力大致可分為三類：①化學和基因毒性壓力：大量的環(huán)境污染物如煙霧和烴類會改變肺部微環(huán)境，IL-33分泌增多，導致過度的炎癥反應。②代謝壓力：糖尿病、肥胖癥、厭食等其他代謝性疾病與體內(nèi)代謝異常，形成促炎環(huán)境。③氧化應激壓力：癌癥患者體內(nèi)產(chǎn)生自由基和可溶性介質(zhì)如：花生四烯酸的代謝產(chǎn)物、細胞因子、趨化因子，進一步誘導活性氧自由基的生成。壓力素促進細胞外壓力傳導到微環(huán)境，有助于組織修復。當受到長時間和高強度的生理應激時，壓力素持續(xù)釋放，不斷傳遞危險信號，引發(fā)慢性炎癥可導致病理損傷[4]。

目前發(fā)現(xiàn)的警報素家族成員主要包括以下幾類：①抗菌肽(Antimicrobial peptides and proteins，AMPs)家族，哺乳動物的抗菌肽主要分為兩大類：防御素(Defensins)和Cathelicidins(具有保守的Cathelin區(qū)域的抗菌肽)；②高遷移率族蛋白(High mobility group,HMG)，一種含量僅次于組蛋白的染色質(zhì)結(jié)合蛋白,研究較多的是高遷移率族蛋白B(High mobility group B,HMGB)、高遷移率族蛋白N(High mobility group N,HMGN)及高遷移率族蛋白A(High mobility group A,HMGA)；③白細胞介素-1(IL-1)家族中研究較多的是IL-1α及IL-33；④熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)家族，廣泛存在于原核生物與真核生物中，在熱休克、氧化應激等多種細胞損傷時合成；⑤ S100蛋白(S100 proteins)鈣結(jié)合家族，研究較多的是S100A8和S100A9；⑥三磷酸腺苷(ATP)嘌呤家族；⑦冷誘導RNA結(jié)合蛋白(Cold-inducible RNA binding protein,CIRP)是DAMP的新成員，屬于冷休克蛋白(CSPs)[5-7]。在沒有損傷和感染時，警報素發(fā)揮著重要的生理功能。在壓力和生理應激、組織損傷、炎癥反應時迅速釋放，激活和增強機體免疫防御系統(tǒng)。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)警報素也是炎癥強有力的調(diào)停者，參與心臟、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)等的修復和重構、炎癥消退，對于維持組織穩(wěn)態(tài)有重要作用，也是臨床疾病診斷和治療預后的分子標志物[8]。

1 警報素在急性創(chuàng)傷中的作用

研究表明,創(chuàng)傷后死亡率呈雙峰分布，在嚴重損傷或出血性休克時出現(xiàn)第一重打擊，刺激宿主固有免疫系統(tǒng)對炎癥及時反應，且炎癥反應的程度與損傷的嚴重程度有關。接下來，如果患者存活，系統(tǒng)性炎癥就會被進一步增強，如缺血/再灌注、外科治療和機會性感染時，將會導致第二重打擊，出現(xiàn)第二次死亡高峰。第二重打擊導致的“細胞因子風暴”，即誘導細胞過度和持續(xù)的釋放促炎和抗炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 等，致使多種器官功能障礙，增加了敗血癥風險[8，9]。

當機體受到非常嚴重的創(chuàng)傷時，HMGB1作為機體晚期的促炎介質(zhì)，在30～60 min內(nèi)釋放，24～48 h達到頂峰[8]，致使各器官系統(tǒng)功能障礙(MODS)，發(fā)生全身炎癥反應綜合征(SIRS)，最后可能引發(fā)敗血癥。有研究顯示，對無菌性炎癥侵染的患者進行抗HMGB1治療，有助于緩解出血性休克、局部缺血/再灌注、急性肺損傷、心肌缺血、大腦缺血性卒中的患者病情。此外，當體內(nèi)LPS含量稍有升高，S100A8/S100A9復合物在體內(nèi)的水平會隨之增加，使用S100A8/S100A9阻斷劑可以提高患者存活率[8，9]。近來，人們越來越關注線粒體來源的DAMPs在大量創(chuàng)傷性疾病中的關鍵作用，它在嚴重受傷的患者體內(nèi)，呈顯著性升高，通過激活中性粒細胞，誘導其遷移和脫顆粒，進而引起相關器官受損[10]。

2 警報素與慢性炎癥反應

警報素招募不成熟DC，吞噬抗原，歸巢到次級淋巴結(jié)，將抗原表位提呈給初始T細胞，導致適應性免疫應答，維持炎性狀態(tài)。持續(xù)釋放的警報素可能誘導MHCⅠ類和MHCⅡ類分子表達，提呈以前未遇到的抗原，同時促進抗原特異性T細胞分化，防止活化誘導的細胞凋亡，導致局部高炎癥反應[8]。

在動脈粥樣硬化(AS)病程中，平滑肌細胞(SMCs)、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、泡沫細胞、活性血小板在受刺激的情況下會分泌HMGB1。當巨噬細胞被動脈粥樣硬化斑塊浸潤時，HMGB1表達增多，誘導平滑肌細胞趨化，增強內(nèi)皮細胞血管黏附因子的表達，有助于斑塊中膽固醇晶體的形成，引發(fā)炎性反應[11]。氧化敏感性的S100A8/A9作為氧化產(chǎn)物的清道夫，避免細胞內(nèi)其他成分受到氧化損傷，促進傷口愈合。此外，有研究表明，在斑塊破裂后S100A12水平大幅上升，可作為評估冠狀動脈疾病的生物學標記物[12]。

中風又稱腦卒中(Ischemic stroke)或腦血管意外，是一組以急性起病，局灶性或彌漫性腦功能缺失為共同特征的腦血管病，發(fā)病前有長期的慢性基礎病變，如高血壓、動脈粥樣硬化等[13]。中風后，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和血管間質(zhì)被破壞，非正常凋亡的死亡細胞的碎片釋放HMGB1、HSP、ATP、S100蛋白等內(nèi)源性DAMPs，激活免疫系統(tǒng)導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(Central nervous system，CNS)。卒中后，低灌注區(qū)域的細胞死亡,數(shù)小時內(nèi)釋放HMGB1，擾亂血腦屏障[14]；S100A8/A9是由缺血的腦組織中浸潤性巨噬細胞釋放，同樣發(fā)揮促炎作用；死亡細胞釋放類視黃醇X受體(PXRs)激活免疫細胞上的TLR2和TLR4，引發(fā)IL-1β、IL-23等炎性細胞因子的釋放，對神經(jīng)細胞起到保護作用，延遲炎癥反應。缺血性腦卒中發(fā)生后，DAMPs在受損部位引發(fā)無菌性炎癥，大約持續(xù)一周，且隨著急性炎癥加重組織損傷導致細胞進一步死亡，繼而釋放更多的DAMPs，這提示治療中風可以從清除DAMPs入手。有最新研究詳細闡述了卒中后損傷抑制機制，中風后3 d內(nèi)，在缺血小鼠實驗模型中，轉(zhuǎn)錄因子MAFB作為單核細胞和成骨細胞分化的重要介質(zhì)，促進巨噬細胞清道夫受體(Macrophage scavenger receptor，MSR1)的表達，介導浸潤的單核細胞吞噬DAMPs，清除炎癥反應和防止神經(jīng)損傷。PXRs激動劑可以促進MAFB的表達，Am80的作用最為明顯，在卒中24 h后靜脈注射Am80，MRS1表達下調(diào)，DAMPs內(nèi)化明顯，有效減少了神經(jīng)損傷和梗死面積[15]。

老年癡呆癥(Alzheimer′s disease，AD)是最常見的神經(jīng)退行性病變，導致漸進性的記憶喪失和認知功能障礙。HMGB1、S100B、S100A8、HSP等直接參與到神經(jīng)性炎癥的免疫活動中。PRRs存在于AD患者的大腦小膠質(zhì)細胞、星型膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞，當DAMPs大量釋放時，激活信號傳導通路，導致神經(jīng)性炎癥。往腦內(nèi)室注射HMGB1，加速神經(jīng)元細胞死亡和突觸破壞，AD患者的臨床癥狀進一步惡化。此外，HSP在退行性疾病中扮演著重要角色，各類神經(jīng)元細胞如反應活性星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞都能誘導HSP70分泌，起到神經(jīng)保護作用，還能促進神經(jīng)細胞的正常功能[16]。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性的以中性粒細胞浸潤為特征的慢性肺部疾病，導致慢性支氣管炎、小氣道纖維化和肺氣腫，有害氣體和顆粒是COPD的主要危險因素。Pouwels[17]及我們的研究均表明，吸煙人群相比于不吸煙人群的肺液或肺血清中HMGB1、S100A8/A9以及IL-37的含量有所增加?；颊咴谑艿较銦煷碳r，促使內(nèi)皮細胞釋放IL-33，減少了Th2細胞相關細胞因子(IL-5、IL-13)的分泌，增加了其在巨噬細胞和NK細胞中的表達，促使TNF-α、IL-12和IFN-γ的釋放，從而加重COPD患者炎癥[18]。我們還發(fā)現(xiàn)吸煙導致凋亡清除分子乳脂球表皮生長因子8表達降低，導致死亡細胞清除減少，DAMPs進一步增加[18]。

3 警報素與自身免疫性疾病

在膠原誘導性關節(jié)炎或缺氧條件下，滑膜巨噬細胞和成纖維細胞主動分泌HMGB1，使得它在血清和滑膜液中的水平上升，所以類風濕性關節(jié)炎(RA)患者較正常機體有更高的HMGB1水平。研究發(fā)現(xiàn)，用抗HMGB1的單克隆抗體、血栓調(diào)節(jié)蛋白、重組HMGB1拮抗劑降低HMGB1的含量，能有效地減弱炎癥，緩解RA[19]。血清和關節(jié)滑膜液中的IL-33在RA活動期大幅升高，當外用重組IL-33治療，反而促使肥大細胞分泌大量促炎細胞因子，加重關節(jié)炎癥[12]。此外，RA患者的巨噬細胞，中性粒細胞分泌S100A8/A9增多，且其在體內(nèi)的濃度與疾病的嚴重程度有關[18]。關節(jié)滑液蛋白中S100A8/A9和S100A12的水平可特異性鑒別RA與其他類型的炎性關節(jié)炎[20]。另外，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)，損傷皮膚或血清中HMGB1水平與疾病活躍程度呈正相關，有助于臨床分期[12]。

4 警報素與腫瘤

HMGN1在抗腫瘤免疫中有多重生物學活性。首先，在細胞核內(nèi)，HMGN1作為染色質(zhì)的結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構、基因表達和核心組蛋白的翻譯后修飾，影響DNA修復和腫瘤發(fā)展。其次，當遇到有害物質(zhì)，細胞內(nèi)鈣離子變化以及炎癥刺激時，上皮細胞釋放HMGN1，細胞外的HMGN1可作為極化Th1的警報素，促進了先天性和適應性的抗腫瘤免疫應答[21]。HMGN1的抗腫瘤活性是對機體的保護作用，有助于DNA的修復，維持基因的完整性。另外，腫瘤也會影響到HMGN1的分泌，隨著癌癥的惡化，它在機體內(nèi)的水平下降，細胞更容易發(fā)生突變[22]。S100A8/A9 也與許多腫瘤密切相關，通過激活 p38 MAPK,直接作用于腫瘤細胞，促進它的轉(zhuǎn)移。此外胞外低濃度的S100A8/9也可以通過與RAGE受體結(jié)合，促進血管形成，有利于腫瘤生長。S100家族有效促進炎癥，招募吞噬細胞，促進腫瘤細胞遷移和生長，有望成為抗腫瘤免疫的目標[23]。此外，腫瘤核心低氧壞死的細胞會釋放HMGB1，維持炎癥微環(huán)境，進一步促進腫瘤的生長和增加其侵襲性。最近有研究表明，死亡的癌細胞釋放的警報素可以與抗癌治療相結(jié)合，改善抗腫瘤免疫反應[11]。HMGB1對腫瘤是具有雙重作用的，它既能是癌癥發(fā)展的中心調(diào)控者，有助于腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管形成和免疫逃逸，又能與TLR4結(jié)合作用于成熟DC，促進炎癥反應，激活抗腫瘤免疫，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。臨床上通過減少HMGB1受體，抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移，有助于抗腫瘤免疫[24，25]。

5 警報素與器官移植

器官移植是治療終末期器官衰竭的一種手段，影響移植物的存活因素主要包括以下幾個方面:①移植術后免疫抑制劑的長期應用會抑制患者正常的免疫系統(tǒng)，可導致嚴重的感染以及多種腫瘤的發(fā)生；②免疫抑制劑會產(chǎn)生包括肝腎毒性在內(nèi)的多種毒性反應；③慢性排斥反應，是影響術后移植物存活的最主要因素[23]。

心臟移植失敗的主要原因是由于慢性移植排斥反應所導致的血管阻塞、心肌缺血，最終使移植心臟失去功能或出現(xiàn)功能障礙。Miller等[26]通過小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，IL-33 可通過誘導 Th1 細胞向 Th2 細胞轉(zhuǎn)換抑制移植后血管阻塞過程。此外，在慢性心臟排斥模型中，也證明 IL-33 可以通過增加 Th2 型細胞的比例和髓源性抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC) 來延長移植心臟的存活時間。心臟移植小鼠預先接受IL-33 的治療可能通過促進 Th1 細胞應答向Th2 細胞應答的轉(zhuǎn)換，并增加免疫耐受的Treg和MDSC 的細胞數(shù)量，減少炎癥反應，提高移植成功率[27]。

6 警報素作為分子標記物與治療靶標

警報素可以作為分子標記物，它的表達與釋放與組織損傷程度和炎癥進程密切相關，可以用來評估疾病嚴重程度，提示臨床及時干預，降低發(fā)病率，還有助于監(jiān)測療效和預后[8]。

針對警報素及其信號傳導通路，通過免疫調(diào)節(jié)的方式進行臨床治療還有幾個亟待解決的關鍵問題。①在面對參與臨床疾病的多種警報素時，我們不確定它們之中是否存在某個警報素起主導作用，該如何去選擇我們的治療靶標？②選擇好治療靶標之后，如何降低其在體內(nèi)的濃度？研究表明，使用中和抗體或者拮抗劑是較好的解決方法，由于不同的警報素在模式識別受體上的一致性，那么阻斷這些受體或它們的下游胞內(nèi)信號傳導可能更為有效，但由于許多病原微生物與警報素共享模式識別受體，如TLR4，針對于這些受體的治療可能增加感染的風險。③抑制炎癥要有度，完全廢除宿主防御也是有害的，會增加患者機會性感染和腫瘤發(fā)生的概率，損傷組織修復和重建途徑。這個平衡問題涉及到劑量調(diào)節(jié)，需要加強對不同濃度警報素對應的生理功能的研究[8]。

7 挑戰(zhàn)與展望

警報素與臨床多種類型的疾病密切相關，可以作為合適的分子標記物，為疾病診斷提供可信賴的依據(jù)，對療效和預后進行評估，也可應用于腫瘤治療或與疫苗聯(lián)合應用于感染預防。

參考文獻：

[1] Vénéreau E,Ceriotti C,Bianchi ME.DAMPs from cell death to new life[J].Front Immunol,2015,6:422.

[2] Matzinger P.Tolerance,danger,and the extended family[J].Ann Rev Immunol,1993,12(1):991-1045.

[3] Oppenheim JJ,Yang D.Alarmins:chemotactic activators of immune responses[J].Current Opinion Immunol,2005,17(4):359-365.

[4] Rider P,Voronov E,Dinarello CA,etal.Alarmins:feel the stress[J].J Immunol,2017,198(4):1395-1402.

[5] Zanetti M.Cathelicidins,multifunctional peptides of the innate immunity[J].J Leukocyte Biol,2004,75(1):39-48.

[6] 蘇斌濤,崔天盆.細胞死亡清除的趨化和危險信號分子[J].醫(yī)學分子生物學雜志,2011,8(6):538-541.

Su BT,Cui TP.Chemokines and dangerous signal molecules of cell death clearance [J].J Med Mol Biol,2011,8(6):538-541.

[7] Khan MM,Yang WL,Brenner M,etal.Cold-inducible RNA-binding protein(CIRP) causes sepsis-associated acute lung injury via induction of endoplasmic reticulum stress[J].Scientific Rep,2017,7:41363.

[8] Chan JK,Roth J,Oppenheim JJ,etal.Alarmins:awaiting a clinical response[J].J Clin Invest,2012,122(8):2711.

[9] Ma KC,Schenck EJ,Pabon MA,etal.The role of danger signals in the pathogenesis and perpetuation of critical Illness[J].Am J Respir Crit Care Med，2018,197(3)：300-309.

[10] Zhang Q,Raoof M,Chen Y,etal.Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury[J].Nature,2010,464(7285):104.

[11] Boteanu RM,Suica VI,Uyy E,etal.Alarmins in chronic noncommunicable diseases:Atherosclerosis,diabetes and cancer.[J].J Proteomics,2016,153:21-29

[12] Bertheloot D,Latz E.HMGB1,IL-1α,IL-33 and S100 proteins:dual-function alarmins[J].Cell Mol Immunol,2017,14(1):43-64.

[13] Cully M.Neurological disorders:DAMPening damage after stroke[J].Nat Rev Drug Dis,2017,16(6):385-385.

[14] Samary CS,Pelosi P,Silva PL,etal.Immunomodulation after ischemic stroke:potential mechanisms and implications for therapy[J].Critical Care,2016,20(1):391.

[15] Shichita T,Ito M,Morita R,etal.MAFB prevents excess inflammation after ischemic stroke by accelerating clearance of damage signals through MSR1[J].Nat Med,2017,23(6):723-732.

[16] Venegas C,Heneka MT.Danger-associated molecular patterns in Alzheimer′s disease[J].J Leukocyte Biol,2017,101(1):87-98.

[17] Pouwels SD,Hesse L,Faiz A,etal.Susceptibility for cigarette smoke-induced DAMP release and DAMP-induced inflammation in COPD.[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2016,311(5):L881.

[18] Wang Y,Luo G,Chen J,etal.Cigarette smoke attenuates phagocytic ability of macrophages through down-regulating Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) expressions[J].Sci Rep，2017，7:42642.

[19] O′Reilly S.Pound the alarm:danger signals in rheumatic diseases[J].Clin Sci,2015,128(5):297-305.

[20] Nefla M,Holzinger D,Berenbaum F,etal.The danger from within:alarmins in arthritis[J].Nat Rev Rheumatol,2016,12(11):669-683.

[21] Yang D,Tewary P,de la Rosa G,etal.The alarmin functions of high-mobility group proteins[J].Biochim Biophys Acta,2010,1799(1):157-163.

[22] Yang D,Bustin M,Oppenheim JJ.Harnessing the alarmin HMGN1 for anticancer therapy[J].Immunotherapy,2015,7(11):1129-1131.

[23] Land WG,Agostinis P,Gasser S,etal.Transplantation and damage-associated molecular patterns(DAMPs)[J].Am J Transplantation,2016,16(12):3338-3361.

[24] Hernandez C,Huebener P,Schwabe RF.Damage-associated molecular patterns in cancer:a double-edged sword[J].Oncogene,2016,35(46):5931-5941.

[25] He SJ,Cheng J,Feng X,etal.The dual role and therapeutic potential of high-mobility group box 1 in cancer[J].Oncotarget,2017，8(38)：64534-64550.

[26] Miller AM,Xu D,Asquith DL,etal.IL-33 reduces the development of atherosclerosis[J].J Exp Med,2008,205:339-346.

[27] Yang,Han Z,Oppenheim JJ.Alarmins and immunity[J].Immunol Rev，2017，280(1):41-56.