基于量效融合評價優(yōu)選腸安Ⅰ號方提取工藝

劉宇 鄭蕊 王鳳云 唐旭東 馬祥雪 石嘯雙 孫巧紅 金靜

[摘要] 目的 藥效學(xué)結(jié)合有效成分含量優(yōu)選腸安Ⅰ號方的提取工藝，并探究復(fù)方中有效成分含量與藥效學(xué)指標(biāo)間的相關(guān)性。 方法 通過小鼠止瀉及鎮(zhèn)痛試驗確定最佳提取工藝路線，并通過SPSS 17.0軟件對腸安Ⅰ號方治療腸易激綜合征的有效成分與藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析。 結(jié)果 腸安Ⅰ號方最佳提取工藝路線為全方水提，其有效成分芍藥苷含量與鎮(zhèn)痛率呈正相關(guān)（P < 0.01），與腹瀉指數(shù)無明顯相關(guān)性（P > 0.05）。 結(jié)論 采用量效融合法評價優(yōu)選最佳提取工藝是科學(xué)合理的，為中藥提取工藝的優(yōu)化提供了一種新的思路，同時也為腸安Ⅰ號方的臨床應(yīng)用提供了可靠的實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 腸安Ⅰ號方；腸易激綜合征；提取工藝；量效

[中圖分類號] R574.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（a）-0021-04

Optimized extraction technology of Chang′an No.Ⅰ based on dose-effect fusion evaluation method

LIU Yu1 ZHENG Rui1 WANG Fengyun2 TANG Xudong2 MA Xiangxue2 SHI Xiaoshuang2 SUN Qiaohong1 JIN Jing1

1.Manufacturing Laboratory of Chinese Medicine， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China； 2.Department of Spleen and Stomach Diseases， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

[Abstract] Objective To optimize the extraction technology of Chang′an No.Ⅰ by pharmacodynamics combined with active ingredient contents， and to explore the correlation between active ingredient contents and pharmacodynamics indicators. Methods The antidiarrheal and analgesic tests were used to optimize the best extraction process. SPSS 17.0 software was used to analyze the Pearson correlation between the active ingredients of Chang′an No.Ⅰ in the treatment of irritable bowel syndrome and pharmacodynamics indicators. Results The best optimal extraction process of Chang′an No.Ⅰ was water extract. There was a positive correlation between paeoniflorin content and analgesic rate （P < 0.01）， and there was no significant correlation between paeoniflorin content and diarrhea index （P > 0.05）. Conclusion It is scientific and reasonable to evaluate and optimize the extraction process by dose-effect fusion method. It provides a new way to optimize the extraction process of Chinese medicine， and also provides a reliable experimental basis for the clinical application of Chang′an No.Ⅰ.

[Key words] Chang′an No.Ⅰ； Irritable bowel syndrome； Extraction process； Dose-effect

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種常見的功能性腸病，其癥狀復(fù)雜多樣，易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。腸安Ⅰ號方是唐旭東教授在經(jīng)典名方痛瀉要方的基礎(chǔ)上結(jié)合20余年臨床經(jīng)驗優(yōu)選出的中藥復(fù)方，遵循中醫(yī)對腹瀉型IBS的疏肝健脾、溫中固澀的治則及立法，按照方藥的君、臣、佐、使組方，該方由炒白芍、炒白術(shù)、防風(fēng)、姜炭等藥味組成，具有疏肝健脾、溫中散寒止瀉之效[2]。優(yōu)化該方的研究從1999年開始，有研究提示該方可降低實驗大鼠的內(nèi)臟高敏感性[3-4]，改善患者的腹痛腹脹癥狀，臨床療效顯著[5-6]。

為提高臨床使用的便捷性，本研究對腸安Ⅰ號方進(jìn)行了工藝研究。通過藥效學(xué)試驗結(jié)果和指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果初選了腸安Ⅰ號方的提取工藝路線[7]，并將有效組分含量與藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析[8-10]，為臨床治療IBS新藥的研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Angilent 1100高效液相色譜儀（美國Angilent公司，DAD檢測器）；Agilent Z0RBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ME4002E型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，1/10萬]；BRANSON 8510E（美國Branson超聲波有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（國華電器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵[邦西儀器科技（上海）有限公司]；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（純度95.2%，批號：110736-201640），購自中國食品藥品檢定研究院。

處方中炒白芍、炒白術(shù)、防風(fēng)、姜炭等飲片均購自河北百草康神藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定均符合2015年版《中國藥典》飲片標(biāo)準(zhǔn)，含量測定結(jié)果均合格。

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；磷酸（分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）；屈臣氏飲用水（蒸餾法制，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 實驗動物

SPF級小鼠200只，雌雄各半，6周齡，體重18～22 g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）20146-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～26℃，相對濕度40%～70%。

2 方法與結(jié)果

2.1 腸安Ⅰ號方不同提取物的制備

提取物Ⅰ（水提）：按處方比例稱取飲片，加水提取2次，第1次加8倍量水提取1.5 h，第2次加6倍量水提取1.0 h，合并提取液，濃縮至相對密度1.3（70℃），60℃減壓干燥，即得。

提取物Ⅱ（水提醇沉）：按處方比例稱取飲片，加水提取2次，第1次加8倍量水提取1.5 h，第2次加6倍量水提取1.0 h，合并提取液，濃縮至含生藥1 g/mL；加95%乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)50%，濾過，上清液回收乙醇至無醇味，濃縮至相對密度1.3（70℃），60℃減壓干燥，即得。

提取物Ⅲ（炒白芍等水提，防風(fēng)等提油）：炒白芍等7味藥按照工藝Ⅰ水提，防風(fēng)、柴胡加6倍量水提取揮發(fā)油10 h，收集揮發(fā)油備用，提取液與水提液合并，濃縮至相對密度1.3（70℃），60℃減壓干燥，即得。

提取物Ⅳ（炒白芍等水提醇沉，防風(fēng)等提油）：炒白芍等7味藥按照工藝Ⅱ水提醇沉，防風(fēng)、柴胡加6倍量水提取揮發(fā)油10 h，收集揮發(fā)油備用，提取液與回收乙醇的水提醇沉液合并，濃縮至相對密度1.3（70℃），60℃減壓干燥，即得。

提取物Ⅴ（炒白芍等水提，防風(fēng)等醇提）：炒白芍等7味藥按照工藝Ⅰ水提，防風(fēng)、柴胡加6倍量60%乙醇提取2次，每次1.0 h，濾過，上清液回收乙醇至無醇味，與水提部分濃縮液合并，60℃減壓干燥，即得。

提取物Ⅵ（炒白芍等水提醇沉，防風(fēng)等醇提）：炒白芍等7味藥按照工藝Ⅱ水提醇沉，防風(fēng)、柴胡加6倍量60%乙醇提取2次，每次1.0 h，濾過，上清液回收乙醇至無醇味，與水提醇沉部分無醇濃縮液合并，60℃減壓干燥，即得。

2.2 芍藥苷含量測定

2.2.1 色譜條件 Agilent Z0RBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（12∶88）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長230 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL[11]。見圖1。

2.2.2 芍藥苷含量測定結(jié)果 提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ生藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.11、6.31、4.33、5.64、4.50、6.96 mg/g，出膏率依次為24.35%、15.85%、23.08%、17.72%、22.24%、14.37%。芍藥苷占提取物和生藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其轉(zhuǎn)移率結(jié)果見表1。

2.3 止瀉試驗

2.3.1 分組與給藥 小鼠90只，雌雄各半，分別雙色標(biāo)記編號，采用隨機數(shù)字表法將其分為九組，分別為空白對照組，空白模型組，陽性對照組，腸安Ⅰ號提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，每組10只，雌雄各5只?？瞻讓φ战M和空白模型組灌胃給予20 mL/kg純化水，陽性對照組灌胃馬來酸曲美布汀0.078 g/kg，腸安Ⅰ號提取物各組日給藥劑量均為15.470 g/kg（按生藥量計）。各組小鼠灌胃7 d，除空白對照組外，各組均于末次灌胃后1 h給予蓖麻油20 mL/kg，并將每只小鼠單獨置于清潔的代謝籠，籠底墊干凈濾紙，計數(shù)1 h內(nèi)干糞數(shù)和濕糞數(shù)，計算稀便率，稀便率=稀便數(shù)/總便數(shù)×100%；稀便級以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級，分為4級：1級為污染直徑<1 cm，2級為污染直徑1～<2 cm，3級為污染直徑2～<3 cm，4級為污染直徑≥3 cm。平均稀便級=每只動物的所有稀便級之和/稀便數(shù)。腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級。根據(jù)稀便率和平均稀便級計算出腹瀉指數(shù)[12-13]。

2.3.2 對蓖麻油所致小鼠腹瀉的影響 如表2所示，與空白對照組比較，空白模型組小鼠在蓖麻油的作用下，腹瀉指數(shù)顯著增加（P < 0.01）。與空白模型組比較，腸安Ⅰ號提取物Ⅰ組在蓖麻油作用0～1 h、1～2 h、2～3 h均呈顯著的腹瀉抑制作用（P < 0.05或P < 0.01），可以顯著降低蓖麻油作用4 h內(nèi)的腹瀉指數(shù)（P < 0.01），其止瀉作用與馬來酸曲美布汀相當(dāng)。

2.3.3 相關(guān)性分析 通過SPSS 17.0軟件將六組提取物中芍藥苷的含量分別與不同時間段的腹瀉指數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析，芍藥苷含量與0～1 h、1～2 h、2～3 h、3～4 h時間段腹瀉指數(shù)的相關(guān)系數(shù)r分別為-0.605、-0.290、-0.312、-0.151。結(jié)果提示，不同時間段芍藥苷含量與小鼠腹瀉指數(shù)無明顯相關(guān)性，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4 鎮(zhèn)痛試驗

2.4.1 分組與給藥 小鼠80只，雌雄各半，分別雙色標(biāo)記編號，采用隨機數(shù)字表法將其分為八組，分別為空白模型組，陽性對照組，腸安Ⅰ號提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，每組10只，雌雄各5只。空白模型組灌胃給予20 mL/kg純化水，陽性對照組灌胃阿司匹林0.026 g/kg，腸安Ⅰ號提取物各組日給藥劑量均為15.470 g/kg（按生藥量計）。各組小鼠灌胃5 d。第5天灌胃后，各組小鼠均于末次給藥后20 min，按照10 mL/kg，腹腔注射0.6%冰醋酸（冰醋酸溶液臨用前配制）。冰醋酸注射后，將小鼠置于清潔的小鼠飼養(yǎng)箱中，小鼠將有軀干伸張、腹部內(nèi)凹、臀部抬高等扭體表現(xiàn)，觀察20 min內(nèi)小鼠發(fā)生扭體反應(yīng)（扭體反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)：伸展后肢、軀體扭曲、腹部內(nèi)凹和臀抬高）次數(shù)，并記錄每只小鼠發(fā)生初次扭體的時間，計算扭體發(fā)生率和鎮(zhèn)痛率[14-16]。扭體發(fā)生率=該組發(fā)生扭體反應(yīng)的鼠數(shù)/該組鼠數(shù)；鎮(zhèn)痛率=（對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/對照組扭體次數(shù)。

2.4.2 對化學(xué)刺激所引起疼痛的鎮(zhèn)痛作用 如表3所示，與空白模型組比較，腸安Ⅰ號提取物Ⅰ組及陽性對照組的初次扭體時間均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；而腸安Ⅰ號提取物Ⅰ組與陽性對照組的初次扭體時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與空白模型組比較，腸安Ⅰ號提取物Ⅰ、Ⅲ組和陽性對照組的扭體次數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。腸安Ⅰ號提取物Ⅰ組鎮(zhèn)痛率較高。

2.4.3 相關(guān)性分析 采用SPSS 17.0軟件將六組提取物中芍藥苷的含量與鎮(zhèn)痛率進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果提示，芍藥苷含量與小鼠鎮(zhèn)痛率呈正相關(guān)（r = 0.940，P < 0.01）。

3 討論

腸安Ⅰ號方以炒白芍、炒白術(shù)、姜炭等為主要藥味，具有疏肝健脾、溫中散寒止瀉之效，用于治療腹瀉型IBS。因中藥復(fù)方組成復(fù)雜，藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，本研究以小鼠止瀉試驗和鎮(zhèn)痛試驗對工藝路線進(jìn)行初步考察，使優(yōu)選的工藝更加科學(xué)、合理[17-18]，且與臨床應(yīng)用劑型相吻合。

方中炒白芍柔肝緩急止痛，針對腹瀉腹痛而設(shè)為君藥，且白芍炒用性緩，柔肝，和脾，止瀉[19]。將芍藥苷含量與鎮(zhèn)痛率進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步提示其具有鎮(zhèn)痛之功效。據(jù)文獻(xiàn)報道，白芍經(jīng)炒制后芍藥苷含量有所下降，而芍藥內(nèi)酯苷及苯甲酰芍藥苷含量均有所升高[20]，推斷芍藥苷并非止瀉的關(guān)鍵或唯一成分。腸安Ⅰ號方中發(fā)揮直接止瀉作用的有效成分有待進(jìn)一步挖掘。

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（收稿日期：2018-05-07 本文編輯：張瑜杰）