鉤吻總堿對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

李德森 ，廖華軍 ，蘇志敏 ，陳 亮 ，王文義 ，陳 欣 ，吳水生

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.永春縣醫(yī)院，福建 永春 362600；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院，福建 福州 350001）

鉤吻總堿對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

李德森1，廖華軍1，蘇志敏2，陳 亮3，王文義1，陳 欣1，吳水生1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.永春縣醫(yī)院，福建 永春 362600；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院，福建 福州 350001）

目的 研究鉤吻總堿對(duì)雞胚絨毛尿囊膜（CAM）新生血管生成的影響。 方法 制備CAM模型，取50個(gè)雞胚隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組（鉤吻總堿高、中、低劑量組），于CAM上植入混合纖維素酯微孔濾膜藥物載體，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的鉤吻總堿，空白對(duì)照組不加藥品，陽性對(duì)照組加入PBS溶液，觀察各組CAM新生血管生長(zhǎng)的情況。 結(jié)果 鉤吻總堿高、中劑量組及陽性對(duì)照組均有抑制CAM新生血管生成作用，而鉤吻總堿低劑量組無抑制作用，與空白對(duì)照組作用相當(dāng)。 結(jié)論 鉤吻總堿具有抑制CAM新生血管生成的作用，并呈量效關(guān)系。

雞胚絨毛尿囊膜；新生血管生成；鉤吻總堿

鉤吻 Gelsemiumelegans（Gardn.etChamp.）Benth.系馬錢科Loganiaceae鉤吻屬Gelsemium植物，生物堿既是其活性成分，也是毒性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、散瞳、抗腫瘤、抑制心臟收縮、升壓、抑制平滑肌、促進(jìn)免疫等多種藥理功能［1-2］。長(zhǎng)期以來，民間將鉤吻用于治療風(fēng)濕痹痛、濕疹、皮癬、神經(jīng)痛等癥，其具有良好的抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、散瞳、影響免疫功能等多種藥理功能，尤其在延長(zhǎng)肝癌患者生存期和腫瘤患者鎮(zhèn)痛方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［3］。惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，新生血管形成是必要條件，近年來，抗腫瘤血管生成已成為腫瘤防治的一個(gè)重要途徑。而鉤吻是否能影響血管生成，通過系統(tǒng)性的文獻(xiàn)回顧，并未發(fā)現(xiàn)鉤吻總堿對(duì)血管生成的實(shí)驗(yàn)研究。雞胚絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）技術(shù)因具有取材方便、易于觀察、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、實(shí)驗(yàn)周期短、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于血管生成及轉(zhuǎn)移等研究［4］，因此本實(shí)驗(yàn)擬研究鉤吻總堿對(duì)CAM血管生成的抑制情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與儀器 鉤吻總生物堿提取物［5］（以下簡(jiǎn)稱鉤吻總堿），由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，用二甲基亞砜（DMSO）溶液配制成 500 mg·mL-1的母液，于 4℃保存待用，實(shí)驗(yàn)時(shí)配制成低劑量（50 μg·mL-1）、中劑量（100 μg·mL-1）、高劑量（200 μg·mL-1）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、甲醛、丙酮、石蠟、新潔爾滅（福州精銳生物技術(shù)有限公司）；YZ-875SA型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化集團(tuán)公司）；CO-25型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；高壓消毒鍋（HVE50，上海天呈科技有限公司）；數(shù)碼相機(jī)［D90／18-200，尼康映像儀器銷售（中國(guó)）有限公司］；混合纖維素酯微孔濾膜（孔徑0.22 μm，上海興亞凈化材料廠）。手術(shù)相關(guān)器械由福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 種蛋 貴妃雞受精種蛋，重量45～55 g，購(gòu)自江西省吉安市泰和烏雞哥生態(tài)農(nóng)場(chǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CAM模型制備 參照文獻(xiàn)［6-8］。

2.1.1 雞胚準(zhǔn)備 新鮮種雞蛋50只，以0.1%新潔爾滅消毒，待種蛋表面干燥后，置于恒溫孵育箱，設(shè)置溫度37.8℃、相對(duì)濕度60%的環(huán)境中孵化，每日自動(dòng)翻轉(zhuǎn)2次，第3天檢卵燈照蛋，拋棄無血管雞胚。

2.1.2 開窗 雞胚發(fā)育3 d，選取發(fā)育良好的雞胚，用酒精棉球消毒2遍，在超凈工作臺(tái)無菌條件下于外殼上開10 mm×10 mm大小的開口，暴露絨毛尿囊膜，具體操作如下：① 取雞胚，于檢卵燈下標(biāo)記氣室及胎位，并在胎位附近無大血管處畫一記號(hào)；用碘酒、乙醇消毒氣室頂部和記號(hào)處，然后在氣室頂部鉆一小孔，同時(shí)用小鋼鋸在記號(hào)處將卵殼磨一個(gè)和縱軸平行的裂痕，勿傷及殼膜；將卵平放，輕輕將裂痕處卵殼去掉，勿傷及殼膜；于殼膜上刺破一小縫但不傷及下面的絨毛尿囊膜，滴加無菌生理鹽水一滴于殼膜上；用橡皮乳頭從氣室端小孔處緩緩將氣室內(nèi)空氣吸去，造成氣室負(fù)壓，此時(shí)可見生理鹽水下沉，絨毛尿囊膜下陷，殼膜與尿囊膜之間形成人工假氣室。② 用無菌透明膠帶將假氣室封好，繼續(xù)孵化3 d后將高溫消毒后的混合纖維素酯微孔濾膜（孔徑 0.22 μm、直徑 6 mm）為載體，小心放置于矩形窗口的邊緣1／3處，遠(yuǎn)離已形成的致密血管網(wǎng)。

2.2 分組給藥 混合纖維素酯微孔濾膜植入后，將種蛋隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組（PBS組）及實(shí)驗(yàn)組（鉤吻總堿高、中、低劑量組）5組，每組10個(gè)雞胚。用微量加樣器加樣，空白對(duì)照組不加任何藥品，陽性對(duì)照組滴加0.5 mg·mL-1PBS，實(shí)驗(yàn)組分別滴加含鉤吻總堿 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1藥液，各組劑量均為 10 μL。加樣后用無菌透明膠帶封閉窗口，繼續(xù)孵化3 d。每12 h觀察1次。

2.3 標(biāo)本采集 加入藥物繼續(xù)孵化3 d后，揭去雞胚表面無菌透明膠帶，以甲醇和丙酮混合液（1∶1）室溫固定15 min，以載體為中心剪下CAM約3 cm×3 cm，展鋪于濾紙上，晾干。以濾紙為背景，由專人觀察裸眼可及的載體周圍的血管數(shù)并進(jìn)行比較。在自然光線下，將尼康D90／18-200數(shù)碼相機(jī)固定在三角架上，禁用閃光燈，采用近距離模式拍照，放大2倍，觀察載體周圍新生血管生成情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布用（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 雞胚存活情況 加藥后48 h，鉤吻總堿高劑量組死亡2個(gè)，陽性對(duì)照組、鉤吻總堿中劑量、低劑量組各死亡1個(gè)。死亡雞胚顏色變淺，胚內(nèi)呈水樣，血管影不清晰，無胚胎活動(dòng)。存活雞胚血管呈鮮紅色，胚胎活動(dòng)正常。

3.2 CAM血管形態(tài)學(xué)比較 空白對(duì)照組血管呈分級(jí)生長(zhǎng)，走形清晰，主血管管徑明顯較粗；陽性對(duì)照組和鉤吻總堿高、中劑量組血管數(shù)量少，顏色偏淺；鉤吻總堿低劑量組血管亦呈分級(jí)生長(zhǎng)，走形清晰。見圖 1。

圖1 各組CAM血管形態(tài)比較圖（×3）

3.3 各組CAM大、中血管生成數(shù)比較 見表1。

表1 各組CAM血管生成數(shù)比較（x±s） 支

4 討 論

鉤吻生物堿毒性太大［9］，治療量和中毒量非常接近，安全指數(shù)較小。1945 年，Algire［10］提出了“腫瘤血管生成的概念”，即腫瘤的生長(zhǎng)具有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段。研究［11］表明：當(dāng)惡性腫瘤體積大于1 mm3時(shí)，主要靠生成腫瘤血管獲取養(yǎng)分，故腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴腫瘤新生血管的形成。因此，抑制新生血管生成，已成為抑瘤抗癌、防止惡性腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可行方法。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鉤吻總堿作用于CAM，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)加藥后有雞胚死亡現(xiàn)象，可能跟雞胚開窗后失去蛋殼和蛋膜保護(hù)致胚胎脫水過多有關(guān)［12］，亦不能排除鉤吻生物堿的毒副作用。在抑制CAM血管生成方面，鉤吻總堿低、中、高劑量組給藥后血管生成呈遞減趨勢(shì)，說明CAM血管的抑制與鉤吻總堿具有量效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鉤吻總堿對(duì)CAM具有抑制血管生成作用，由于CAM血管新生為正常生成而腫瘤血管新生為異常生成，鉤吻生物堿抗腫瘤作用與腫瘤血管新生是否相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)的劑量難以直接換算，且體內(nèi)外藥物代謝存在差別，鉤吻總堿對(duì)于抑制荷瘤動(dòng)物模型腫瘤血管新生的有效劑量也有待進(jìn)一步探索。

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0030-02

2017-09-20

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014-S-140-1）

李德森（1982—），男，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事中藥學(xué)藥性理論研究。

吳水生（1965—），男，教授，博士生導(dǎo)師，醫(yī)學(xué)博士。E-mail：498366498@qq.com