風(fēng)味蛋白酶水解鴨骨工藝優(yōu)化

劉光憲，祝水蘭，周巾英，朱雪晶，馮健雄，*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江西 南昌 330200； 2.江西師范大學(xué) 功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330022)

風(fēng)味蛋白酶水解鴨骨工藝優(yōu)化

劉光憲1，2，祝水蘭1，周巾英1，朱雪晶1，馮健雄1，*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江西 南昌 330200； 2.江西師范大學(xué) 功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330022)

為了實(shí)現(xiàn)鴨骨副產(chǎn)物的綜合利用，以鴨骨為原料，通過(guò)測(cè)定酶解產(chǎn)物的抗氧化能力及水解度，確定最適用酶為風(fēng)味蛋白酶。研究底物濃度、風(fēng)味蛋白酶用量、酶解溫度、pH、酶解時(shí)間5個(gè)因素對(duì)鴨骨蛋白水解度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)確定鴨骨風(fēng)味蛋白酶酶解的最佳工藝條件為：底物濃度2%，風(fēng)味蛋白酶用量7 000 U·g-1，酶解溫度45 ℃，pH值6.0，酶解時(shí)間5 h。在此條件下鴨骨蛋白的水解度為17.10%。

鴨骨；風(fēng)味蛋白酶；水解度；正交試驗(yàn)

鴨骨是肉鴨加工過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品之一，約占鴨總重的8%～17%[1]。鴨骨的主要成分有水分、粗蛋白、礦物質(zhì)和脂肪，其中，蛋白質(zhì)的含量較高[2]，其氨基酸組成及比例、疏水性與鴨骨在加工生產(chǎn)過(guò)程中的特征風(fēng)味有很大關(guān)系[3]。鴨骨蛋白水解液含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸，包括人體所需多種必需氨基酸[4]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功效；然而，由于缺乏合理可行的加工技術(shù)及配套設(shè)備，目前鴨骨加工利用程度較低，附加值不高。鴨骨的高值化加工利用是鴨肉加工中亟待解決的問(wèn)題[5]。

生物酶解技術(shù)具有高效、反應(yīng)溫和、對(duì)氨基酸結(jié)構(gòu)影響小等優(yōu)點(diǎn)[6]，被廣泛用于制備蛋白肽，但不同的酶由于具有不同的酶切點(diǎn)，因此，酶解產(chǎn)物亦不盡相同，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味各異[7]。目前，禽骨酶解多采用堿性蛋白酶[4]，該酶具有較好的水解度，但酶解液存在不同程度的苦味問(wèn)題。相關(guān)研究表明，風(fēng)味蛋白酶能有效水解苦味肽，可減少或去除肽的苦味[8-9]；因此，風(fēng)味蛋白酶或許可以代替堿性蛋白酶應(yīng)用于禽骨蛋白酶解中，克服堿性蛋白酶酶解帶來(lái)的問(wèn)題。

近年來(lái)，關(guān)于鴨骨的精深加工研究，多限于鴨骨的主要成分分析、氨基酸組成分析，以及鴨骨糜、骨粉等初級(jí)產(chǎn)品的加工等方面[4,10-11]，關(guān)于不同酶制劑對(duì)鴨骨酶解的效果，及活性肽制備工藝優(yōu)化等的研究較少。本文對(duì)比幾種蛋白酶在鴨骨酶解方面的效力，篩選出最佳酶制劑，并對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，為鴨骨的加工利用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

新鮮鴨骨，由江西煌上煌集團(tuán)食品股份有限公司提供。堿性蛋白酶(2.4 AU·g-1)、復(fù)合蛋白酶(1.5 AU·g-1)、中性蛋白酶(1.5 AU·g-1)和風(fēng)味蛋白酶(1.0 AU·g-1)購(gòu)于丹麥諾維信公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼購(gòu)于Sigma公司；無(wú)水乙醇、水楊酸等試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XL-200A型粉碎機(jī)，上海潤(rùn)實(shí)電器有限公司；B-260型恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；TP-214型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL-10C型高速臺(tái)式離心

機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KDY-9820型凱氏定氮儀，北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；SynergyHT型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鴨骨架處理

剔除骨架上殘留的肉、脂肪、皮等非骨物質(zhì)，清洗、破碎后于125 ℃高壓蒸煮60 min。將軟化后的鴨骨去油脂，烘箱中50 ℃烘干6 h，利用高速組織搗碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，分裝，置于-18 ℃冰箱中冷凍備用。試驗(yàn)前解凍鴨骨粉，取一定量的鴨骨粉于燒杯中，超純水加熱溶解，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至所需的pH值。

1.2.2 鴨骨粉蛋白含量測(cè)定

參照GB 5009.5—2010，凱氏定氮法測(cè)定鴨骨粉蛋白質(zhì)含量，其蛋白含量為24.8%±0.4%。

1.2.3 蛋白酶篩選

將鴨骨粉配制成蛋白質(zhì)含量為 20 mg·mL-1的溶液，加酶酶解，酶的種類及酶解條件見(jiàn)表1。酶解后，沸水浴滅酶10 min，7 500 r·min-1離心10 min，取上清液測(cè)定DPPH自由基、羥基自由基清除率及水解度，篩選出最佳蛋白酶。

1.2.4 抗氧化能力測(cè)定

DPPH清除能力測(cè)定。參照Brand-William等[12]的方法，稍作修改。用95%乙醇配制0.2 mmol·L-1DPPH溶液，取100 μL酶解液與100 μL DPPH溶液于96孔酶標(biāo)板混合均勻，常溫避光反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)定吸光值D1。以100 μL 95%乙醇代替DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為空白組，測(cè)定吸光值D0；以100 μL DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為對(duì)照組，測(cè)定吸光值D2。DPPH·清除率(EDPPH)計(jì)算公式如下：

EDPPH/%=(D2-D1)/(D2-D0)×100。

(1)

羥自由基清除能力測(cè)定。根據(jù)劉晶晶等[13]

表14種酶的酶解條件

Table1Hydrolytic conditions of enzymes

酶EnzymeSC/%EA/(U·g-1)pHT/℃t/h堿性蛋白酶Alkalineprotease2600080554中性蛋白酶Neutralprotease2600070504風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme2600060504復(fù)合蛋白酶Compoundprotease2600070504

SC，底物濃度；EA，加酶量；T，酶解溫度；t，酶解時(shí)間。

SC， Substrate concentration; EA， Enzyme amount;T， Reaction temperature;t， Reaction time.

的方法，取1.0 mL酶解液，依次加入2 mL 1.8 mmol·L-1FeSO4、1.5 mL 1.8 mmol·L-1水楊酸-乙醇和0.1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2，37 ℃水浴30 min。反應(yīng)結(jié)束后取200 μL混合液于96孔酶標(biāo)板，使用酶標(biāo)儀在510 nm處測(cè)定吸光值Di，以去離子水代替樣品液的吸光值為DCK，羥自由基清除率(E)計(jì)算公式如下：

E/%=(DCK-Di)/DCK×100。

(2)

1.2.5 水解度測(cè)定

以游離氨基酸的測(cè)定為參照，利用Nielsen等[14]的方法，測(cè)定游離氨基酸的含量。取0.2 mL樣品溶液，加入4 mL鄰苯二甲醛試劑，室溫反應(yīng)2 min后立即于340 nm處測(cè)吸光值，以去離子水替代樣品溶液作空白對(duì)照。

水解度(%)=(水解后溶液的游離氨基含量-水解前游離氨基含量)/總氨基含量×100。

1.3 酶解工藝研究

1.3.1 單因素試驗(yàn)

以篩選出的最適酶為材料，以水解度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別研究底物濃度(2%、4%、6%、8%、10%、12%)，酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)、反應(yīng)pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)、酶添加量(4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U·g-1)對(duì)鴨骨粉水解度的影響。

1.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳酶解工藝條件。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2017軟件作圖，在SPSS 17.0軟件平臺(tái)上進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選

4種蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶)對(duì)鴨骨均具有較好的水解性(圖1)，其中，堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶制備的鴨骨肽的抗氧化活性略高于其他蛋白酶制備的鴨骨肽，但堿性蛋白酶制備的鴨骨肽具有苦味，而風(fēng)味蛋白酶制備的鴨骨肽沒(méi)有苦味。綜上，選取風(fēng)味蛋白酶作為本試驗(yàn)的水解酶，這與丁安子等[15]的研究報(bào)道相一致。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 底物濃度對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響

如圖2所示，隨著底物濃度增大，水解度呈下降趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，水解度最大。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%～6%之間時(shí)，水解度無(wú)顯著變化(P>0.05)；當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?%，其水解度顯著(P<0.05)降低。這可能是因?yàn)榈孜餄舛冗^(guò)大導(dǎo)致水解液黏度過(guò)大，影響酶的擴(kuò)散，從而抑制了酶解反應(yīng)。因此，選擇2%的底物濃度較為合適。

不同處理無(wú)相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同Treatments followed by no same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below圖1 4種蛋白酶的鴨骨水解度及其產(chǎn)物的抗氧化活性Fig.1 Hydrolysis degree of duck bone under 4 proteases on antioxidant activity after hydrolyzation

圖2 底物濃度對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on proteolysis of duck bone

2.2.2 風(fēng)味蛋白酶用量對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響

從圖3可以看出，隨著風(fēng)味蛋白酶用量增加，鴨骨蛋白的水解度顯著(P<0.05)增加。這可能是因?yàn)槊附夥磻?yīng)初期，底物與酶的相互作用未達(dá)到飽和。當(dāng)酶加入量超過(guò)7 000 U·g-1時(shí)，水解度不再顯著增加，此時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡。

2.2.3 酶解溫度對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響

如圖4所示，水解度隨著酶解溫度的增加先顯著增大(P<0.05)后顯著(P<0.05)減小，酶解溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，水解度最大。這可能是因?yàn)樵?5 ℃以下時(shí)，隨著酶解溫度增加，體系內(nèi)能逐漸增大，酶與底物之間的接觸面積增大，反應(yīng)速度加快，即酶催化能力增強(qiáng)，酶活力增大。然而，酶是一種生物活性蛋白，當(dāng)其所處的環(huán)境溫度高于某個(gè)點(diǎn)時(shí)，酶蛋白的特定結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，酶的活性也會(huì)降低，直至完全失活，即當(dāng)酶解溫度大于45 ℃時(shí)，酶的活性開(kāi)始下降，引起水解度隨之降低。

圖3 風(fēng)味蛋白酶用量對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on proteolysis of duck bone

2.2.4 pH值對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響

從圖5可見(jiàn)，隨著pH值的增大，水解度先顯著(P<0.05)增加。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，水解度達(dá)到最大。之后，水解度較pH值為6.0時(shí)顯著(P<0.05)降低。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響

從圖6可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間在1～5 h之間時(shí)，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，水解度顯著(P<0.05)增加，之后不再顯著增長(zhǎng)。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間在5 h以內(nèi)時(shí)，鴨骨蛋白呈飽和狀態(tài)，遵循零級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)向著產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行，水解度不斷增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到5 h以后，反應(yīng)進(jìn)入平衡點(diǎn)，水解度達(dá)到最大值。

圖5 pH對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響Fig.5 Effect of pH on proteolysis of duck bone

圖6 酶解時(shí)間對(duì)鴨骨蛋白酶解的影響Fig.6 Effect of reaction time on proteolysis of duck bone

2.3 正交試驗(yàn)

影響蛋白水解的各因素并不是孤立的，它們之間是相互關(guān)聯(lián)的。鴨骨的酶解反應(yīng)必須考慮到風(fēng)味蛋白酶用量、底物濃度、酶解溫度、體系pH值及酶解時(shí)間等的影響[16]。鑒于當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%～6%時(shí)，鴨骨蛋白水解度受底物濃度的影響較小，故固定底物濃度為2%，選擇酶解溫度(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、風(fēng)味蛋白酶用量(C)、pH值(D)4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，以水解度為指標(biāo)，確定最佳工藝條件。正交試驗(yàn)各因素水平設(shè)置見(jiàn)表2。

正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。影響水解度的各因素依次為風(fēng)味蛋白酶用量>pH值>酶解時(shí)間>酶解溫度。以水解度為指標(biāo)時(shí)，制備鴨骨肽的最佳工藝組合為A2B3C3D2，即酶解溫度45 ℃，底物濃度2%，酶解時(shí)間5 h，風(fēng)味蛋白酶用量7 000 U·g-1，pH值6.0。在此工藝條件下，蛋白水解度為17.10%。

表2正交試驗(yàn)因素水平表

Table2Orthogonal factors design

水平LevelA/℃B/hC/(U·g-1)D140350005524546000603505700065

表3正交試驗(yàn)結(jié)果

Table3Results of orthogonal experiment

試驗(yàn)序號(hào)No．ABCD水解度Hydrolysisdegree/%111111277212221670313331621421231473522311621623121571731321621832131424933211571k115227145701424014897k215550157171571316207k315387158771621015060R0323130719701310

3 小結(jié)

本研究對(duì)比了4種蛋白酶(堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶)對(duì)鴨骨肽水解度、抗氧化活性的影響，篩選出最佳酶制劑為風(fēng)味蛋白酶。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)，獲得鴨骨肽的最佳酶解工藝為：酶解溫度45 ℃，底物濃度2%，酶解時(shí)間5 h，風(fēng)味蛋白酶用量7 000 U·g-1，pH值6.0。在此條件下，鴨骨蛋白的水解度為17.10%。

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Optimizationofduckboneenzymolysisbyflavourzyme

LIU Guangxian1，2， ZHU Shuilan1， ZHOU Jinying1， ZHU Xuejing1， FENG Jianxiong1，*

(1.InstituteofAgriculturalProductsProcessing，JiangxiAcademyofAgriculturalSciences，Nanchang330200，China; 2.KeyLaboratoryofFunctionalSmallOrganicMolecule，MinistryofEducation，JiangxiNormalUniversity，Nanchang330022，China)

To comprehensively utilize the byproduct of duck bone， duck bone was selected as the study object. By measuring the antioxidant activity and hydrolysis degree， it was confirmed that the flavourzyme was the optimal enzyme. The effects of substrate concentration， enzyme amount， reaction temperature， pH value and reaction time on duck bone hydrolyzation were studied. Futhermore， the optimal process for duck bone hydrolyzation was obtained by orthogonal test as follows: substrate concentration 2%， enzyme amount 7 000 U·g-1， reaction temperature 45 ℃， pH value 6.0， and reaction time 5 h. Under this condition， the hydrolysis degree of duck bone reached 17.10%.

duck bone; flavourzyme; hydrolysis degree; orthogonal test

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2128-2133

http://www.zjnyxb.cn

劉光憲，祝水蘭，周巾英，等. 風(fēng)味蛋白酶水解鴨骨工藝優(yōu)化[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(12)： 2128-2133.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.23

2017-09-06

江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金(2015CQN002)；江西省科技計(jì)劃(20161BBF60134)

劉光憲(1982—)，男，云南宣威人，博士，助理研究員，主要從事食品加工方面的研究。E-mail: liugx178@163.com

*通信作者，馮健雄，E-mail: fjx630320@163.com

TS251.9

A

1004-1524(2017)12-2128-06

(責(zé)任編輯高 峻)