一株具有抑菌活性的酸棗內(nèi)生菌的分離

鄧振山，魏婷婷，蘇 瑞，高 飛，劉玉珍，陳邦凱，莫達(dá)銳，何 茜，許紅霞

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

一株具有抑菌活性的酸棗內(nèi)生菌的分離

鄧振山，魏婷婷，蘇 瑞，高 飛，劉玉珍，陳邦凱，莫達(dá)銳，何 茜，許紅霞

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

采用組織分離法和研磨涂布法篩菌以及對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，C-22-1菌株的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)反復(fù)萃取分離得到有抗菌活性的物質(zhì)，以抑菌圈大小為指標(biāo)對(duì)C-22-1菌株發(fā)酵條件中的碳源、氮源和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化。C-22-1菌株發(fā)酵液及其活性物質(zhì)對(duì)7種人體常見致病菌抑菌活性測(cè)定顯示，C-22-1菌株發(fā)酵液對(duì)白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)的抑菌圈直徑達(dá)29 mm，定性試驗(yàn)顯示菌株C-22-1產(chǎn)皂苷類物質(zhì)，單因素優(yōu)化結(jié)果表明，菌株C-22-1的最佳碳源、氮源、時(shí)間分別是葡萄糖、酵母膏、8 d。初步確定C-22-1菌株可產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)為三萜皂苷。

陜北酸棗；內(nèi)生菌；組織分離法；研磨涂布法；抑菌活性

植物體內(nèi)普遍存在著內(nèi)生菌，植物內(nèi)生菌(endophyte)是指整個(gè)生活史或者是生活史中的某一階段能夠定殖在宿主植物健康細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞之間，卻不對(duì)其宿主產(chǎn)生病害癥狀的微生物[1-2]，可寄存在植物的根、莖、葉、花、果實(shí)及種子中。近年來(lái)，顏華等[3]、鄭艷等[4]、劉瑩等[5]、劉勝貴等[6]眾多學(xué)者從經(jīng)濟(jì)林木、藥用植物、雜草等植物中分離到大量的內(nèi)生菌，2010年黃海東等[7]從云霧龍膽中分離得到一株內(nèi)生細(xì)菌，它的發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有抑菌效果。

酸棗[ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow.]為鼠李科，廣泛分布于我國(guó)中、北部地區(qū)，抗逆性強(qiáng)，是一種耐旱、耐寒、耐鹽堿的野生藥用植物。酸棗素有“天然維生素丸”之稱，此外酸棗還具有養(yǎng)心安神、補(bǔ)肝、斂汗的功效，主治心煩失眠、驚悸怔忡、體虛多汗、神經(jīng)衰弱、多夢(mèng)、汗少口干等癥狀。孫延芳等[8]發(fā)現(xiàn)酸棗中有酒石酸、檸檬酸、草酸等，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)酸棗果肉中含有多種三萜類化合物[9-10]如蛇滕酸、麥珠子酸等。王向紅等[11]分析發(fā)現(xiàn)多種棗中的齊墩果酸和熊果酸的含量均顯著低于酸棗。

酸棗中有很多活性物質(zhì)，1997年，首次從酸棗仁中分離得到黃酮類化合物[12]，曾路等[13]分離得到了斯皮諾素和酸棗黃素兩種黃酮類物質(zhì)以及酸棗仁皂苷A、B(jujubosides A、B)。有研究表明，酸棗仁中的黃酮類化合物還有藥黃素[14]、當(dāng)藥素(swertisin)、異斯皮諾素(isospinosin)、6″-對(duì)香豆酰斯皮諾素(6″-p-coumaroylspinsin)[15]、異牡荊素(isovitexin)[16]、槲皮素(quercetin)[17]。酸棗仁中含有的皂苷類物質(zhì)有酸棗仁皂苷A1、B1、C[18]、D[19]，羽扇環(huán)烷型三萜類化合物有羅珠子酸甲酯。

目前對(duì)酸棗的研究也很多，但對(duì)酸棗內(nèi)生菌的研究較少，目前僅劉東[20]、高振峰等[21]分別從山西酸棗體內(nèi)分離獲得76株內(nèi)生細(xì)菌和40株內(nèi)生真菌，但有關(guān)陜北酸棗內(nèi)生菌的研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究從陜北酸棗葉片篩選內(nèi)生菌，通過(guò)生物活性測(cè)定的方法選出有抑菌作用的菌株，并對(duì)其內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料的采集

酸棗[ZizyphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu]植株于2015年5月采自延安大學(xué)后山、延安鳳凰山(不帶根)，采樣后立即帶回實(shí)驗(yàn)室供當(dāng)天試驗(yàn)使用，剩余的葉片置于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 指示菌株

指示菌株均來(lái)于延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏，指示菌編號(hào)見表1。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：(1)PDA培養(yǎng)基；(2)牛肉膏培養(yǎng)基；(3)高氏培養(yǎng)基；(4)改良培養(yǎng)基1：葉片煮沸濾液1 000 g、NaCl 5 g、蔗糖10 g、瓊脂18 g、pH 自然；(5)改良培養(yǎng)基2∶NaCl 1 g、CaCl20.5 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.02 g、(NH4)2SO41 g、MgSO4· 7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g 、NaCl 5 g、MgSO45 g、K2HPO41 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；

優(yōu)化培養(yǎng)基：(1)碳源篩選用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g·L-1)：各種碳源3 g、蛋白胨10 g、K2HPO43 g、MgSO4· 7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL、pH自然。(2)氮源篩選用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖3 g、各種氮源10 g、K2HPO43 g、MgSO4· 7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL、pH自然。

1.2 方法

表1指示菌株編號(hào)

Table1Indicator strain number

菌株編號(hào)No．ofstrains指示菌株IndicatorstrainP?1大腸埃希菌(Escherichiacoli)P?2傷寒桿菌(Salmonellatyphi)P?3檸檬色葡萄球菌(Staphylococcuscitreus)P?4福氏痢疾桿菌(Shigellaflexneri)P?5白色念球菌(Moniliaalbican)P?6金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)P?7白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)

1.2.1 酸棗葉片內(nèi)生菌的篩選

1.2.2 內(nèi)生菌抑菌活性測(cè)定

挑取備用斜面上的菌種復(fù)壯，無(wú)菌條件下取直徑為10 mm的復(fù)壯菌株的菌餅3～5個(gè)，接種于已滅菌的PDA液體培養(yǎng)基中，置于32 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)器中以160 r·min-1培養(yǎng)18～24 h。無(wú)菌條件下，用無(wú)菌棉簽將致病菌株涂滿牛肉膏固體培養(yǎng)基，接著用直徑10 mm的無(wú)菌打孔器在涂滿致病菌的培養(yǎng)基上打孔并注入內(nèi)生菌發(fā)酵液，對(duì)照組在孔中注入無(wú)菌水，試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 d后觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[22]。

1.2.3 菌種鑒定

生理生化鑒定：篩選的內(nèi)生菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色、甲基紅測(cè)定、V-P 測(cè)定、淀粉水解、吲哚產(chǎn)生和檸檬酸利用檢測(cè)試驗(yàn)，試驗(yàn)測(cè)定方法及初步鑒定方法參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[23]。

16S rRNA鑒定：采用菌落PCR[24]方法擴(kuò)增菌株C-22-1的16S rDNA，采用基因保守序列通用引物，P1(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)和P6(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，50 μL 反應(yīng)體系：2×EsTaqMasterase 25 μL，上下游引物各 1 μL(10 μmol·L-1)，模板DNA 1 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至反應(yīng)總體積50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min；4 ℃保存。獲得的 16S r RNA 基因序列提交到NCBI的GenBank基因庫(kù)，進(jìn)行BLAST比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性分析，運(yùn)用MEGA 6.06軟件生成NJ進(jìn)化樹。

1.2.4 代謝產(chǎn)物的分離提取

將菌株C-22-1擴(kuò)大培養(yǎng)，無(wú)菌條件下，取直徑1 mm的內(nèi)生菌菌餅4～5個(gè)，接種于含200 mL的發(fā)酵液培養(yǎng)基中，接種25瓶，置于32 °C、160 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液離心去菌體，收集并濃縮菌液，將5 L的發(fā)酵液濃縮至300 mL。濃縮后的發(fā)酵液與70%乙醇按體積比1∶9混合后浸泡2 h，40 °C超聲處理10 min，收集液體，濃縮，用正丁醇進(jìn)行萃取，濃縮，再用正丁醇反復(fù)萃取2次，收集液體并用砂芯過(guò)濾裝置過(guò)濾，最后進(jìn)行濃縮并收集。

1.2.5 C-22-1發(fā)酵產(chǎn)物的定性試驗(yàn)

在研究C-22-1菌株所產(chǎn)皂苷的生物活性之前，首先通過(guò)皂苷的通性進(jìn)行定性試驗(yàn)，確定C-22-1菌株發(fā)酵產(chǎn)物的總皂苷中含有皂苷類物質(zhì)，從而對(duì)其進(jìn)行下一步研究。泡沫試驗(yàn)、濃硫酸-乙酸反應(yīng)、氯仿-濃硫酸反應(yīng)、香草醛-高氯酸反應(yīng)參考邵青[25]的方法進(jìn)行定性試驗(yàn)。

HPLC檢測(cè)：甲醇分別溶解標(biāo)準(zhǔn)品、樣品于容量瓶中備用。

皂苷檢測(cè)：色譜柱為Kromasil C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(0.2%磷酸)=50∶50；流速0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫25 °C；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.6 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：菌株C-22-1分別接種于以葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、淀粉為碳源的液體培養(yǎng)基和以蛋白胨、酵母膏、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨為氮源的液體培養(yǎng)基中，在32 °C，恒溫振蕩培養(yǎng)器中以160 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4 d后取出備用。以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為指示菌，參照1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，設(shè)置3重復(fù)。選出最佳碳源、氮源的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵時(shí)間按5、6、7、8、9 d，參照1.2.2節(jié)進(jìn)行試驗(yàn)。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：為了優(yōu)化發(fā)酵條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)菌株C-22-1的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小為響應(yīng)值(Y)，對(duì)碳、氮源和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素與水平(表2)。

表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)表

Table2Response surface design

水平LevelA，葡萄糖A，GlucoseB，酵母膏B，YeastextractC，時(shí)間C，F(xiàn)ermentationtime/d-13875051080151285

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗內(nèi)生菌的篩選

采用組織分離法和研磨涂布法從酸棗葉片組織中共分離得到23株內(nèi)生菌，編號(hào)為C-01-1至C-23-1，C-22-1的發(fā)酵液的抑菌效果好，對(duì)7種人體常見致病菌均有抑制作用，除對(duì)白色念球菌(Moniliaalbican)的抑菌圈直徑為12 mm外，對(duì)其他病原菌的抑菌圈直徑均大于16 mm，抑菌活性強(qiáng)，所以選擇其作進(jìn)一步研究。

2.2 酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定及產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定

對(duì)所分離的內(nèi)生菌的抑菌活性進(jìn)行初步篩選，其中菌株C-22-1對(duì)7種人體常見致病菌的抑制效果均較好(表3)，因此選擇其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)人體常見致病菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果(圖1)顯示，4號(hào)致病菌(福氏痢疾桿菌Shigellaflexneri)的最低抑制濃度最小，對(duì)其抑制效果最好。

2.3 菌株鑒定

菌株C-22-1的菌落特征是表面粗糙，扁平，菌落不規(guī)則，菌株C-22-1的細(xì)胞呈直桿狀，菌落圓形，乳白色，邊緣整齊，光滑；菌株C-22-1的V.P、檸檬酸鹽反應(yīng)均為陰性，產(chǎn)生吲哚、能水解淀粉，甲基紅試驗(yàn)顯陽(yáng)性。菌株C-22-1的16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào)KY393358)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，與其同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，通過(guò)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析可以看出，菌株C-22-1與BacillusgaemokensisKCTC 13318 (登錄號(hào)LTAQ01000012)屬于同一分支即它們有可能為同一類群(圖2)。綜合形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理生化特征和同源性分析，菌株C-22-1為蠟狀芽孢桿菌。

表3C-22-1對(duì)7種致病菌的抑制直徑

Table3Inhibitory effect of C-22-1 on 7 kinds of pathogenic bacteria in diameter

病原菌株P(guān)athogen抑菌圈直徑/mmAntibioticcirclediameter/mmP?12433±1155abABP?22133±1527bBCP?32300±2bABP?42433±4932abABP?51367±2，887cCP?62400±4582abABP?72933±3055aA

同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。

Different from the column data is marked with a lowercase letter， the difference was significant (P<0.05), marked with a different capital letters， the differences were extremely significant (P<0.01).

1，大腸埃希菌(Escherichia coli)；2，傷寒桿菌 (Salmonella typhi)；3，檸檬色葡萄球菌(Staphylococcus citreus)；4，福氏痢疾桿菌 (Shigella flexneri)；5，白色念球菌(Monilia albican)圖1 C-22-1產(chǎn)物對(duì)5種致病菌的抑制直徑Fig.1 Inhibitory effect of C-22-1 on 5 kinds of pathogenic bacteria in diameter

圖2 菌株C-22-1的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenntic tree of strain C-22-1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 C-22-1發(fā)酵產(chǎn)物的定性試驗(yàn)結(jié)果

(1)泡沫試驗(yàn)：樣品產(chǎn)生了肥皂樣泡沫，且15 min后泡沫仍未消失，空白對(duì)照處理雖然也出現(xiàn)泡沫，但量極少且在30 s內(nèi)消失，此結(jié)果也可以初步說(shuō)明C-22-1粗皂苷樣品中可能含有皂苷。

(2)濃硫酸-乙酸反應(yīng)：試管內(nèi)顯示紅色，并未出現(xiàn)污綠色，說(shuō)明樣品中含有三萜皂苷。

(3)氯仿-濃硫酸反應(yīng)：試驗(yàn)結(jié)果顯示溶液出現(xiàn)分層，在氯仿層顏色為淺紅色，硫酸層出現(xiàn)綠色的熒光?？瞻讓?duì)照試驗(yàn)則無(wú)此色澤變化。

(4)香草醛-高氯酸反應(yīng)：試管溶液最終顯示紅色。香草醛-高氯酸反應(yīng)是皂苷類物質(zhì)的顯色方法，高氯酸的酸性極強(qiáng)，可與皂苷發(fā)生氧化反應(yīng)使其脫氫，再與香草醛作用繼而形成特征性的紅色。

(5)HPLC檢測(cè)：由圖3-a-可以發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間大約在3.762 min，受樣品中雜質(zhì)等干擾的影響，兩個(gè)圖譜存在一定的差別，但兩圖譜就總體對(duì)比而言，C-22-1正丁醇部位的樣品的出峰時(shí)間和柴胡皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間大致相同(圖3-b)，因此可以初步判定C-22-1正丁醇部位提取的樣品中含有皂苷類物質(zhì)。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

由圖4-a可知，菌株C-22-1以葡萄糖為碳源時(shí)抑菌圈最大，故最優(yōu)碳源選為葡萄糖；由圖4-b可以看出，菌株C-22-1以酵母膏為氮源時(shí)抑菌圈最大，因此最佳氮源為酵母膏；由圖4-c可知，菌株C-22-1在發(fā)酵前8 d抑菌圈也呈上升趨勢(shì)，第9天開始下降，因此最佳發(fā)酵時(shí)間為8 d。

回歸模型P<0.01表明，回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.392，不顯著，說(shuō)明該模型成立，回歸模型中一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2、B2、C2以及AC的交互作用對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈的影響極顯著(P<0.01)。

a， 柴胡皂苷A標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖；b， C-22-1正丁醇部位提取的樣品的HPLC色譜圖a， Saiko saponin A standard HPLC chromatogram；b， C-22-1 N-butanol extraction HPLC chromatogram of the sample圖3 HPLC色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography (HPLC) figure

圖4 不同碳源、氮源、時(shí)間對(duì)菌株C-22-1抑菌活性的影響Fig.4 Effect of different carbon source， nitrogen source and time on antibacterial activity of strain C-22-1

響應(yīng)曲面能直觀地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，交互作用不顯著時(shí)，表現(xiàn)為曲線較為平滑，近似圓形，交互作用極顯著時(shí)表現(xiàn)為曲線較陡，接近橢圓形。由圖5可以看出，A和B、C和D的交互作用不顯著，A和C的交互作用顯著，與表4結(jié)果基本一致。

利用Design-Expert 8.06軟件得出菌株C-22-1的最佳發(fā)酵條件為葡萄糖4.28 g·L-1，酵母膏10.12 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間8.01 d，考慮到實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵條件設(shè)定為葡萄糖4.30 g·L-1，酵母膏10 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間8 d。

3 討論

從菌株C-22-1發(fā)酵液及活性物質(zhì)抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示其對(duì)人體一些常見致病菌的抑制效果很明顯，可以為藥物制備提供種質(zhì)資源。有研究者從酸棗植株中分離提取出黃酮類、皂苷類化合物[26]，菌株C-22-1可以產(chǎn)生皂苷類化合物，這可能與內(nèi)生菌與宿主植物長(zhǎng)期共生的協(xié)同演化有關(guān)。盡管初步鑒定了兩株菌代謝產(chǎn)物均含有黃酮、皂苷類化合物，但還需要進(jìn)一步對(duì)其代謝產(chǎn)物分離純化。從HPLC圖中可看出樣品中雜質(zhì)較多，純度低，需要借助紫外光譜、質(zhì)譜、紅外光譜、核磁共振等技術(shù)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

植物內(nèi)生菌可在離體培養(yǎng)的條件下，采用發(fā)酵獲得大量活性物質(zhì)[27]，從而解決某些藥用植物資源緊缺、生長(zhǎng)緩慢和生態(tài)破壞等問(wèn)題。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸棗內(nèi)生菌可合成多種活性物質(zhì)，具有廣譜的抗菌作用。本試驗(yàn)采用組織分離法和研磨涂布法從陜北酸棗葉片中篩選內(nèi)生菌共23株，包括20株內(nèi)生細(xì)菌，內(nèi)生細(xì)菌占總數(shù)的86.96%，初步證實(shí)酸棗葉片中內(nèi)生菌種類豐富。經(jīng)測(cè)定得到10株有抑菌活性的菌株，占分離總數(shù)的43.48%。其中菌株C-22-1對(duì)七種病原菌以及與幾種常用抗生素相比，C-22-1發(fā)酵液均具有較強(qiáng)的抑菌效果，所以選其進(jìn)行更多的研究。本試驗(yàn)還對(duì)菌株C-22-1發(fā)酵的主要影響因素碳源、氮源以及發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化分析，明確碳源、氮源和時(shí)間對(duì)菌株抑菌活性的影響，以及得出最佳發(fā)酵條件。

表4回歸模型方差分析

Table4Regression model variance analysis

變異源Source平方和SS自由度df均方MSF值FvalueP值Pvalue顯著性Significance模型Model151099117691678879085168007914100006SignificantA?葡萄糖231125123112524909545800016??B?酵母膏0101251010125109122401803309C?時(shí)間040510405436489607400751AB00025100025002694380308743AC0811081872979214800013??BC0091009096997690503575A＾21413918421114139184211523853572<00001??B＾2692551692557463972286<00001??C＾2210760526312107605263227147603400020??殘差Residual0649570092785714失擬項(xiàng)Lackoffit025753008583333308758503405244notsignificant純誤差Pureerror039240098總誤差Cortotal298211764716

表5方差分析其他參考項(xiàng)

Table5Other variance analysis references

參考項(xiàng)Referenceitems數(shù)值Value參考項(xiàng)Referenceitems數(shù)值Value標(biāo)準(zhǔn)偏差Std．Dev．0304607476R?Squared0978220175Mean2954117647AdjR?Squared0950217543C．V．%1031128452PredR?Squared0841304048PRESS47325AdeqPrecision162226991

圖5 葡萄糖、酵母膏和發(fā)酵時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface of glucose， yeast extract and fermentation time

從酸棗葉片中篩選出的菌株C-22-1的生理生化反應(yīng)以及16S rRNA的結(jié)果與Jung等[28]從潮灘沉積物中篩出來(lái)的菌株BL3-6的結(jié)果一致，結(jié)果顯示，該菌株為蠟狀芽孢桿菌，可以降解石油。

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Isolationofanendophyticbacterialstrainwithantifungalactivityfromwildjujube

DENG Zhenshan， WEI Tingting， SU Rui， GAO Fei， LIU Yuzhen， CHEN Bangkai， MO Darui， HE Xi， XU Hongxia

(CollegeofLifeScience，Yan’anUniversity，Yan’an716000，China)

Using tissue separation and grinding coated method， the endophytes were screened out to study the active substances in the leaves of wildjujubeendophytic microbes and species identification， and the filter method was used to test the antibacterial activities. The fermented product extraction of strain C-22-1 was extracted again and again to gain the antimicrobial substances. The single fermentation conditions of strain C-22-1， including carbon source， nitrogen source and time， were optimized according to the size of inhibition zone. The antibacterial activities of fermented liquid of C-22-1 and the antimicrobial substances were detected to seven human common pathogenic bacteria; the strain C-22-1’s antibacterial circle diameter reached 29 mm toStaphylococcusalbus. Qualitative test showed the strain C-22-1 produce saponins. Single factor optimization results showed that best carbon， nitrogen source and time was glucose， yeast extract and 8 d， respectively. Strain C-22-1 produce antimicrobial substances， which was initially identified as triterpenoid saponins.

wildZizyphusjujube; endophytes; tissue separation method；grinding coated method; antimicrobial activity

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2068-2076

http://www.zjnyxb.cn

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2017-06-14

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程(2012KTZB03-02-03，2012CGX7，2016TTC-N-3-1) ; 延安市科技局重大專項(xiàng)(2014CGZH-06)；陜西省教育廳服務(wù)服務(wù)地方專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)(16JF029)；延安市菌草工程研究中心專項(xiàng)基金；延安市生物資源開發(fā)與利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)基金；延安大學(xué)“陜北微生物資源與利用研究中心” 科研機(jī)構(gòu)專項(xiàng)基金；延安大學(xué)產(chǎn)學(xué)研合作研發(fā)項(xiàng)目

鄧振山(1969—)，男，陜西黃陵人，博士，副教授，主要從事微生物資源與利用和環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail: zhenshandeng214@163.com

S476.1

A

1004-1524(2017)12-2068-09

(責(zé)任編輯張 韻)