鴨坦布蘇病毒E蛋白線性化B細(xì)胞抗原表位的鑒定

張 琳，余 斌，倪 征，陳 柳，云 濤，葉偉成，華炯鋼，崔言順，張 存

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 210021； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

鴨坦布蘇病毒E蛋白線性化B細(xì)胞抗原表位的鑒定

張 琳1，2，余 斌1，*，倪 征1，陳 柳1，云 濤1，葉偉成1，華炯鋼1，崔言順2，張 存1

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 210021； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

為鑒定鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)的B細(xì)胞抗原表位，以純化的DTMUV YY5株為抗原制備了2株單克隆抗體AE4和BD10，研究證實(shí)BD10為線性化表位，其結(jié)合的抗原表位位于E蛋白的第三結(jié)構(gòu)域(Domain Ⅲ，DⅢ)。將DTMUV E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域基因截短為具有末端相互重疊的15段，與MBP融合表達(dá)后以單克隆抗體BD10進(jìn)行肽庫(kù)掃描，結(jié)果篩選出DTMUV一個(gè)B細(xì)胞線性表位385LVGSGKGQI393(EP385)。該表位原核融合表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠制備的抗體，能夠和DTMUV E蛋白反應(yīng)，表明EP385表位具有良好的免疫原性，可為DTMUV多肽疫苗的研制及特異血清學(xué)診斷方法的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

鴨坦布蘇病毒；單克隆抗體；肽庫(kù)掃描；抗原表位

2010年4月以來(lái)，浙江、江蘇、安徽、福建、上海、山東、河北等水禽主產(chǎn)區(qū)先后暴發(fā)一種以蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋量驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元[1]。隨著病原學(xué)研究的深入，該病病原被確定為一種黃病毒，即鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)[2]。近年來(lái)，鴨坦布蘇病毒病的流行呈現(xiàn)地方流行性，是危害我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病。

DTMUV基因組由5’端和3’端非編碼區(qū)和一個(gè)開(kāi)放閱讀框組成，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，其中DTMUV E蛋白由501個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含有1個(gè)糖基化位點(diǎn)[3-4]。根據(jù)黃病毒科病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，推測(cè)DTMUV E蛋白位于病毒表面，參與受體結(jié)合、膜融合和侵入等環(huán)節(jié)，在病毒感染靶細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[4-5]。黃病毒E蛋白在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，即DⅠ，DⅡ，DⅢ結(jié)構(gòu)域[5]。DⅢ結(jié)構(gòu)域是一個(gè)假定的受體結(jié)構(gòu)域，是病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的區(qū)域，其內(nèi)可能含有與病毒致病性相關(guān)的抗原決定簇[6-11]。本研究針對(duì)E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域，融合表達(dá)15個(gè)末端相互重疊的短肽，這些短肽覆蓋E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域的291～406位氨基酸，利用肽庫(kù)掃描精確定位E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域的一個(gè)B細(xì)胞線性表位，為研究基于抗原表位的新型疫苗和診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DTMUV YY5分離株、小鼠骨髓瘤細(xì)胞株(SP2/0)、融合表達(dá)載體pMBP-C為本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；膠回收試劑盒、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker購(gòu)自寶生物公司；Trans10、Trans-T1感受態(tài)購(gòu)自北京全式金公司；蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；弗氏佐劑、PEG3350、HAT、HT購(gòu)自SIGMA公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體制備

將DTMUV YY5株在DF-1細(xì)胞增殖后，采用不連續(xù)蔗糖梯度離心法[3]提純病毒。純化病毒用β-丙內(nèi)酯滅活，進(jìn)行BALB/c小鼠的免疫以及細(xì)胞融合[9]，用間接免疫熒光(IFA)和間接ELISA[12]交叉篩選雙陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)及純化

根據(jù)E蛋白基因序列，遞交生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/software.php)進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)一套覆蓋E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域(AA291-AA406)并盡可能涵蓋預(yù)測(cè)表位的15個(gè)短肽，這些短肽長(zhǎng)約16個(gè)氨基酸，相鄰兩個(gè)短肽末端彼此重疊6～8個(gè)氨基酸。針對(duì)每條短肽合成正負(fù)2條寡核苷酸鏈(表1)，相互配對(duì)，每對(duì)寡核苷酸鏈退火后在5’端和3’端分別形成BamHI和NheI粘性末端。將退火的DNA與經(jīng)BamHI、NheI雙酶切的pMBP-C載體連接，轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細(xì)胞，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(D600=0.6)時(shí)加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h；收集表達(dá)菌體，經(jīng)超聲裂解后，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液以直鏈淀粉樹(shù)脂柱親和層析法純化融合蛋白。10% SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)和純化情況。

1.2.3 抗原表位篩選

E蛋白抗原表位篩選采用間接ELISA法測(cè)定[12]。包被抗原為純化的E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域及其15個(gè)短肽融合蛋白，包被濃度為5 μg·mL-1；封閉液為含5%脫脂乳的PBST(PBS，pH 7.4，含0.1% Tween-20)，37 ℃封閉2 h。一抗為單抗雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37 ℃孵育1 h；二抗為1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育1 h。顯色液為T(mén)MB，避光顯色10 min后加入H2SO4終止液終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸收值。

1.2.4 抗原表位鑒定

以免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)鑒定E蛋白抗原表位。將純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂乳封閉，4 ℃冰箱中過(guò)夜；用PBST洗3次，置于1∶10稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中，室溫孵育1 h；洗滌3次后置于1∶5 000稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，洗滌3次后，以DAB顯色。

1.2.5 抗原表位的抗原性驗(yàn)證

在E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域的15段短肽中，單克隆抗體BD10與E12和E13的2個(gè)相鄰重組蛋白呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，而其他短肽則呈陰性。為此，針對(duì)E12，E13重疊部分(385LVGSGKGQI393)，按大腸桿菌密碼子優(yōu)化合成2條寡核苷酸鏈(F∶5’-gatccAtcttagtaggaagtggaaaaggacagg-3’，R∶5’-ctagcctgtccttttccacttcctactaagaTg-3’)，進(jìn)行表位多肽的表達(dá)和純化。以重組蛋白免疫試驗(yàn)兔制備高免血清，Western Blot檢驗(yàn)其與E蛋白及其表位的免疫反應(yīng)。

表1編碼短肽寡核苷酸序列表

Table1Synthesized DNA sequences which encoding the short peptides

引物Primer引物序列(5’～3’)PrimersequenceE1F：gatccATGCAGGGTTTGAAGCTGAAAGGAATGACCTACCCGATGTGTAGCAATgR：ctagcATTGCTACACATCGGGTAGGTCATTCCTTTCAGCTTCAAACCCTGCATgE2F：gatccATGACCTACCCGATGTGTAGCAATACATTTTCCCTAGTGAAGAATCCTgR：ctagcAGGATTCTTCACTAGGGAAAATGTATTGCTACACATCGGGTAGGTCATgE3F：gatccACATTTTCCCTAGTGAAGAATCCTACCGACACTGGGCATGGCACTGTCgR：ctagcGACAGTGCCATGCCCAGTGTCGGTAGGATTCTTCACTAGGGAAAATGTgE4F：gatccACCGACACTGGGCATGGCACTGTCGTGGTGGAATTGTCTTATGCAgR：ctagcTGCATAAGACAATTCCACCACGACAGTGCCATGCCCAGTGTCGGTgE5F：gatccGTGGAATTGTCTTATGCAGGTACCGATGGGCCCTGTAGAGTTCCCATATCCgR：ctagcGGATATGGGAACTCTACAGGGCCCATCGGTACCTGCATAAGACAATTCCACgE6F：gatccGATGGGCCCTGTAGAGTTCCCATATCCATGTCGGCAGATCTGAATgR：ctagcATTCAGATCTGCCGACATGGATATGGGAACTCTACAGGGCCCATCgE7F：gatccATGTCGGCAGATCTGAATGACATGACACCAGTTGGACGCTTGATAgR：ctagcTATCAAGCGTCCAACTGGTGTCATGTCATTCAGATCTGCCGACATgE8F：gatccATGACACCAGTTGGACGCTTGATAACAGTCAACCCATACGTGTCGgR：ctagcCGACACGTATGGGTTGACTGTTATCAAGCGTCCAACTGGTGTCATgE9F：gatccATAACAGTCAACCCATACGTGTCGACCTCCTCCACGGGTGCCAAGATAgR：ctagcTATCTTGGCACCCGTGGAGGAGGTCGACACGTATGGGTTGACTGTTATgE10F：gatccTACGTGTCGACCTCCTCCACGGGTGCCAAGATAATGGTGGAAGTGgR：ctagcCACTTCCACCATTATCTTGGCACCCGTGGAGGAGGTCGACACGTAgE11F：gatccGCCAAGATAATGGTGGAAGTGGAACCTCCATTCGGGGATTCAgR：ctagcTGAATCCCCGAATGGAGGTTCCACTTCCACCATTATCTTGGCgE12F：gatccCCTCCATTCGGGGATTCATTCATCTTAGTAGGAAGTGGAAAAGGAgR：ctagcTCCTTTTCCACTTCCTACTAAGATGAATGAATCCCCGAATGGAGGgE13F：gatccTTAGTAGGAAGTGGAAAAGGACAGATCAGGTACCAGTGGCATAGAgR：ctagcTCTATGCCACTGGTACCTGATCTGTCCTTTTCCACTTCCTACTAAgE14F：gatccCAGATCAGGTACCAGTGGCATAGAAGTGGGAGCACAATTGGAAAAgR：ctagcTTTTCCAATTGTGCTCCCACTTCTATGCCACTGGTACCTGATCTGgE15F：gatccCATAGAAGTGGGAGCACAATTGGAAAAgR：ctagcTTTTCCAATTGTGCTCCCACTTCTATGg

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體制備

以純化的DTMUV為抗原，按常規(guī)方法進(jìn)行小鼠免疫和細(xì)胞融合，用間接免疫熒光(IFA)和DⅢ-ELISA交叉篩選到2株雙陽(yáng)性單克隆抗體，分別命名為AE4和BD10(圖1)。免疫印跡結(jié)果顯示，BD10能夠特異性地識(shí)別DTMUV E蛋白，而AE4則不能(圖2)。由此推定BD10識(shí)別病毒E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域的線性表位，而AE4可能識(shí)別的是構(gòu)象表位。

A，AE4；B，BD10；C，陽(yáng)性對(duì)照；D，陰性對(duì)照A， AE4； B， BD10； C， positive control； D， negative control圖1 單克隆抗體的間接免疫熒光反應(yīng)Fig.1 IFA results of McAbs against DTMUV

2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

將編碼DTMUV E蛋白的15個(gè)短肽和表位短肽的核苷酸序列，插入大腸桿菌表達(dá)載體pMBP-C，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示在細(xì)胞裂解上清中可見(jiàn)到與目的蛋白大小一致的條帶。將上述可溶性表達(dá)產(chǎn)物過(guò)Amylose親和層析柱純化后，獲得了純化的融合蛋白(圖3)。

2.3 抗原表位的篩選

15段短肽鏈經(jīng)可溶性表達(dá)、純化后，用ELISA 和Western blot法進(jìn)行肽庫(kù)掃描。結(jié)果顯示短肽E12和E13能夠與BD10呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖4，圖5)。E12和E13兩個(gè)融合短肽中，重疊的序列為L(zhǎng)VGSGKGQ(圖6)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該氨基

酸序列，重新設(shè)計(jì)并合成了表達(dá)該短肽的核苷酸序列，經(jīng)原核表達(dá)和Western blot鑒定，結(jié)果顯示385LVGSGKGQ393為單抗BD10所識(shí)別線性表位的核心序列，將該表位命名為EP385。

2.4 抗原表位的抗原性驗(yàn)證

A，BD10；B，AE4。M，marker; 1，MBP；2，MBP-E 重組蛋白A， BD10；B， AE4. M， marker; 1， MBP；2， MBP-E recombinant protein 圖2 單克隆抗體的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of MAb BD10 and AE4

融合表達(dá)的表位短肽純化后免疫小鼠，制備免疫血清，通過(guò)免疫印跡反應(yīng)分析，結(jié)果表明融合的表位短肽能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)表位的特異性抗體，驗(yàn)證385LVGSGKGQ393確實(shí)是B細(xì)胞的1個(gè)線性表位，且具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性(圖7)。

M，marker；1，MBP空載體；E1～E15，MBP-短肽融合蛋白；94102，MBP-EP385M， marker； 1， MBP； E1-E15， MBP-Peptide fusion protein； 94102， MBP-EP385圖3 短肽和表位融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion proteins

圖4 表位的ELISA篩選Fig.4 Mapping of epitopes by ELISA with BD10

3 討論

研究抗原表位有助于了解抗原結(jié)構(gòu)及抗原變異預(yù)測(cè)，為表位疫苗以及分子診斷技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。常用的鑒別B細(xì)胞抗原表位的方法主要有：肽探針掃描技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)等[14]。軟件預(yù)測(cè)雖然簡(jiǎn)單快速，但準(zhǔn)確性欠佳，預(yù)測(cè)結(jié)果只能作為確定各個(gè)蛋白潛在表位的參考，最終還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確認(rèn)[15]。本文以制備的單克隆抗體為研究工具，采用間接ELISA及Western blot法進(jìn)行肽庫(kù)掃描，結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬分析對(duì)抗原表位進(jìn)行研究，取得了較為理想的結(jié)果。

圖5 表位的western blot 篩選Fig.5 Mapping of epitopes by western blot with BD10

圖6 E蛋白表位鑒定結(jié)果示意圖Fig.6 Schematic diagram of E protein epitope identification

M， marker；1，DⅢ重組蛋白；2，MBP-EP385；3，MBP-E融合蛋白M， marker； 1， DⅢ recombinant protein； 2， MBP-EP385； 3， MBP-E recombinant protein圖7 Western blot鑒定抗原表位EP385Fig.7 Western blot confirmation of the epitope EP385

在單克隆抗體制備過(guò)程中，采用間接免疫熒光(IFA)和間接ELISA交叉篩選，獲得AE4和BD10 2株雙陽(yáng)性單克隆抗體。Western blot鑒定結(jié)果顯示，BD10能夠特異性的識(shí)別DTMUV E蛋白，而AE4則不能，由于SDS-PAGE凝膠電泳和轉(zhuǎn)印過(guò)程中蛋白變性，由此推測(cè)單抗BD10識(shí)別DTMUV E蛋白的線性表位，而單抗AE4識(shí)別E蛋白的構(gòu)象表位。為了更詳細(xì)地研究BD10的特異性以及對(duì)其表位進(jìn)行作圖，將DTMUV YY5株E蛋白DⅢ區(qū)截短為具有部分序列重疊的15段短肽，以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)為融合MBP標(biāo)簽的重組蛋白，用肽探針掃描技術(shù)鑒定BD10識(shí)別的核心區(qū)域?yàn)?85LVGSGKGQI393，序列對(duì)比表明該表位序列與GenBank已公布鴨、鵝坦布蘇E蛋白相應(yīng)序列均保守。

鴨坦布蘇病毒病作為一種新發(fā)傳染病，近年來(lái)已經(jīng)傳播至全國(guó)各水禽主產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重影響鴨鵝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[16-18]。本研究鑒定出坦布蘇病毒E蛋白B細(xì)胞線性表位，對(duì)于研究鴨坦布蘇病毒的表位疫苗和建立診斷方法具有重要意義。

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IdentificationoflinearBcellepitopeforEproteinofduckTembusuvirus

ZHANG Lin1，2，YU Bin1，*， NI Zheng1，CHEN Liu1，YUN Tao1，YE Weicheng1，HUA Jionggang1，CUI Yanshun2，ZHANG Cun1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinarySciences，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China；2CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

This experiment was conducted to identify B cell epitope of E protein of duck Tembusu virus (DTMUV). In this study， a linear B cell epitope385LVGSGKGQI393(EP385) for DTMUV E protein were identified by truncated expressing the third domain of E protein (Domain III， DIII)， which is recognized by monoclonal antibody BD10 prepared by the purified DTMUV YY5 strain as antigen， and then by scanning the peptide library which containing 15 overlapping segment of truncated and fused expressed DIIIwith BD10. Then， the immunogenicity of EP385 was verified by fusion expressed inE.coliand immunized mice to prepare a polyclonal antibody which was confirmed to be capable of recognizing viral E protein. The identification of B cell epitope for the E protein of DTMUV may lead to the preparation of a DTMUV peptide vaccine and the development of specific serological diagnostic methods.

duck Tembusu virus; monoclonal antibody; peptide library scanning; epitope

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2009-2014

http://www.zjnyxb.cn

張琳，余斌，倪征，等. 鴨坦布蘇病毒E蛋白線性化B細(xì)胞抗原表位的鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(12)： 2009-2014.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.08

2016-08-22

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500100)；浙江省自然科學(xué)基金(LY15C18002)；浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2016C32070)

張琳(1986—)，女，黑龍江大興安嶺人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物檢疫與食品檢驗(yàn)研究。E-mail: zhanglin_0109@126.com

*通信作者，余斌，E-mail: biogiant@126.com

S858.32

A

1004-1524(2017)12-2009-06

(責(zé)任編輯萬(wàn) 晶)