菊粉酶基因克隆表達(dá)與油脂的組分分析

趙春海，王志鵬，池振明

（1.濱州職業(yè)學(xué)院 生物工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，山東 青島 266000）

菊粉酶基因克隆表達(dá)與油脂的組分分析

趙春海1，王志鵬2，池振明3

（1.濱州職業(yè)學(xué)院 生物工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，山東 青島 266000）

為了實(shí)現(xiàn)解脂亞羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）直接利用菊粉進(jìn)行油脂生產(chǎn)，將外切菊粉酶基因INU1與表達(dá)質(zhì)粒pINA1317連接，在解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC尿嘧啶缺陷突變菌株中表達(dá)。以尿嘧啶缺陷型篩選作為篩選標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)化子C37，經(jīng)過培養(yǎng)菊粉酶酶活達(dá)到37.15 U/mL。在2 L發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)化子C37以菊粉為底物進(jìn)行發(fā)酵，油脂產(chǎn)量和細(xì)胞干質(zhì)量分別為49%和14 g/L。脂肪酸分析結(jié)果顯示棕櫚酸、⒉脂酸和油酸總和占總脂肪酸的92%以上，其中油酸含量高達(dá)59%，表明通過菊粉酶基因在解脂亞羅威亞酵母中的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了以菊粉為底物一步發(fā)酵產(chǎn)單細(xì)胞油脂。

解脂亞羅威亞酵母；菊粉酶；單細(xì)胞油脂；基因表達(dá)

現(xiàn)今環(huán)境問題日益嚴(yán)重，尤其是大氣污染，因此生物油脂進(jìn)行柴油的生產(chǎn)備受關(guān)注。生物柴油不僅可以降解，而且還可以應(yīng)用于現(xiàn)存的機(jī)車中，產(chǎn)生較少量的有害氣體（如二氧化硫），生物柴油產(chǎn)生的二氧化碳凈排放量僅為傳統(tǒng)化石柴油的22%[1-2]。生物柴油可以通過生物油中的甘油三酯的酯交換反應(yīng)來生產(chǎn)[3-5]，單細(xì)胞油脂來源廣泛，多種微生物（如酵母、細(xì)菌、微藻）都能夠積累，單細(xì)胞油脂中研究較多的是酵母和霉菌細(xì)胞內(nèi)的油脂，研究表明，酵母和霉菌油脂積累高于其他生物[6]，同時(shí)酵母具有生長快、積累油脂含量高、與植物油脂十分相似等特點(diǎn)。微生物油脂（如單細(xì)胞油脂）可以通過化學(xué)和酶的催化轉(zhuǎn)化成生物柴油[7]。目前報(bào)道多種酵母都能夠積累油脂，如白色隱球酵母（Cryptococcusalbidus）、彎曲隱球菌（Cryptococcuscurvatus）、圓紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）等，同時(shí)CHUN H Z等[8]研究結(jié)果表明，解脂亞羅威亞酵母（Yarrowialipolytica）以葡萄糖、木糖、甘露糖、甘油、水解淀粉以及農(nóng)副產(chǎn)品殘留物為原料，可發(fā)酵產(chǎn)生單細(xì)胞油脂，油脂積累可達(dá)40%。

目前高昂的制造成本是生物柴油工業(yè)化應(yīng)用的主要障礙，生物柴油高昂的制造成本與原料密切相關(guān)，同時(shí)也失去市場競爭力[9]。因此用廉價(jià)的原料是制造生物柴油從而減低其成本的一個(gè)關(guān)鍵。為了降低酵母生產(chǎn)油脂的成本，必須尋找能替代葡萄糖、谷物為碳源的生產(chǎn)原料，已有報(bào)道采用雪蓮果[10]、纖維素[11]、半纖維素[12]、甘蔗糖液[13]、甘薯[14]、秸稈[15]、生物工業(yè)副產(chǎn)物為原料進(jìn)行單細(xì)胞油脂的發(fā)酵生產(chǎn)[16-19]。

菊粉（菊糖）作為一種貯藏性碳水化合物存在于多種植物的根和莖中[20]，菊粉可以用于高果糖漿生產(chǎn)，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)酒精、油脂，也可以在菊粉酶水解下生產(chǎn)寡菊糖等可再生原料，近來受到越來越多的關(guān)注[21-22]。菊粉酶是一種水解酶，它作用于β-2,1糖苷鍵并將菊粉降解小分子果糖與葡萄糖。目前來源于季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），黑曲霉（Aspergillus niger）的菊粉酶基因已經(jīng)被深入研究并被克隆表達(dá)，重組酶被分離、鑒定[21]。

解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC是一株油脂酵母，能積累大量單細(xì)胞油脂（每克干物質(zhì)含油脂0.44～0.54 g，干物質(zhì)達(dá)到9～12 g/L）[3-7]。但是解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）不含有菊粉酶基因，無法直接利用菊粉進(jìn)行生長合成油脂，為了簡化生產(chǎn)工藝，使解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC直接利用菊粉和含有菊粉的物質(zhì)來積累油脂，降低油脂生產(chǎn)成本，本研究克隆了馬克思克魯維酵母（K.marxianus）CBS6556中的菊粉酶基因，并且與表達(dá)載體pINA1317連接轉(zhuǎn)化尿嘧啶缺陷型的Y.lipolytica ACA-DC。以期實(shí)現(xiàn)一步發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞油脂，拓寬單細(xì)胞油脂合成原料來源，簡化發(fā)酵工藝，同時(shí)為生物柴油的開發(fā)奠定油脂基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

無氨基氮培養(yǎng)基：硫酸銨5g/L，無氨基酵母氮源1.79g/L，葡萄糖10 g/L，共同滅菌，固體培養(yǎng)基加入2.5%瓊脂。

突變株誘變培養(yǎng)基：5-氟乳清酸（5-fluoro whey acid，5-FOA）0.75 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸銨5 g/L，無氨基氮源1.7 g/L，瓊脂25 g/L。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.0。

篩選培養(yǎng)基：將冷卻至50℃的LB液體培養(yǎng)基加入終質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL的氨芐青霉素，瓊脂粉2.5%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：菊糖20g/L，KH2PO40.3g/L，MgSO40.13g/L，NH4Cl 1.3 g/L，酵母粉1.3 g/L，pH6.0。

1.1.2 菌株與載體

pMD18-T、pMD19-T質(zhì)粒：Takara寶生物工程（大連）有限公司；pINA1317質(zhì)粒：國際友人Catherine Madzak饋贈(zèng)，中國海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示；菊粉酶基因的pMD18-T質(zhì)粒（即pMD18-T-INU1）：由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，并保存于中國海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室；解脂亞羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）ACA-DC：希臘學(xué)者Dr.Seraphim Papanikolaou贈(zèng)㈣[3-5]；大腸桿菌（Escherichia coli）：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

圖1 pINA1317質(zhì)粒結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of pINA1317 plasmid

1.1.3 主要試劑

異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG）（分析純）：北京百奧萊博科技有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-gal）（分析純）：美國Amresco公司；聚乙二醇4000-醋酸鋰（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；基因組提取、質(zhì)粒純化、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增、切膠回收試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Microfuge20高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；FA2204電子精密天平：上海京孚儀器有限公司；BYSXT-04索氏提取器：上海秉越電子儀器有限公司；Olimpus CX23顯微鏡：上海賴氏電子科技有限公司；UV-2102 C型紫外分光光度計(jì)：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；2720型PCR儀：德國Eppendorf公司；Mastercycler 5333 GC6890A氣相色譜儀：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 尿嘧啶缺陷型的誘變篩選

pINA1317質(zhì)粒的篩選標(biāo)記為尿嘧啶缺陷型，為了便于快速對轉(zhuǎn)化子的篩選，方法參照文獻(xiàn)[19]對解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC進(jìn)行尿嘧啶缺陷型誘變篩選。

1.3.2 菊糖酶基因的克隆以及表達(dá)載體的構(gòu)建

將實(shí)驗(yàn)室保存pMD18-T-INU1中的菊粉酶基因通過PCR方法分離[2]，將pINA1317質(zhì)粒進(jìn)行SfiI、BamHI雙酶切，通過連接酶將含有SfiI、BamHI的菊粉酶基因連接到經(jīng)雙酶切后pINA1317中，設(shè)計(jì)引物增加SfiI、BamHI限制性酶切位點(diǎn)，上下游引物如下：

上游引物：TCAGTTATCAATTACAAGAGAGATGGTGACAGC

下游引物：TCAATGGTGATGGTGGTGATGAAGGTTAAATTGGGTAACGPCR

反應(yīng)采用50.0 μL體系；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性8 min，94℃變性30 s，51℃退火1.5 min，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物的回收：經(jīng)鑒定后的菊粉酶基因在紫外燈下切下目標(biāo)帶，按照基因回收試劑盒的操作步驟進(jìn)行菊粉酶基因回收。

（1）質(zhì)粒pMD19-T連接

通過菊粉酶基因體外PCR擴(kuò)增，在TaqDNA聚合酶作用下，PCR切膠回收產(chǎn)物3′末端A與含有T末端的pMD19-T在20.0 μL反應(yīng)體系中16℃過夜連接，得到pMD19-T-INU1克隆質(zhì)粒。

（2）pMD19-T-INU1在大腸桿菌中驗(yàn)證

將過夜連接的pMD19-T-INU1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的DH5α細(xì)胞培養(yǎng)混合液分別涂布于含有IPTG和X-gal的平板上，37℃培養(yǎng)，觀察菌落顏色。初步篩選白色菌落為陽性菌落，并進(jìn)一步接種于加氨芐抗生素的篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h[19]。

（3）pINA1317-INU1油脂酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

在25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行BamHI和SfiI雙酶切質(zhì)粒，參照文獻(xiàn) [19]中的方法，進(jìn)行轉(zhuǎn)化油脂酵母，獲得還有pINA1317-INU1的油脂酵母。

1.3.3 單細(xì)胞油脂組分分析

將發(fā)酵的菌體離心干燥研磨成菌粉，采用索氏提取方法進(jìn)行油脂提取[22]，加入，3 mL15%三氟化硼甲醇溶液混勻，50℃水浴1 h，加入等體積正己烷，加入1/2體積的飽和NaCl溶液，混勻，通過氣相色譜儀進(jìn)行脂肪酸組分分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉酶基因的克隆與驗(yàn)證

將pMD18-T-INU1中菊粉酶基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果和基因驗(yàn)證結(jié)果見圖2。

圖2 pMD18-T-INU1中菊粉酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification products of inulinase gene in pMD18-T-INU1

由圖2可知，從保存在pMD18-T-INU1中獲得菊粉酶基因用于構(gòu)建表達(dá)載體，為了便于與表達(dá)載體pINA1317連接，PCR引物設(shè)計(jì)加入限制性內(nèi)切酶SfiI和BamHI對應(yīng)位點(diǎn)，1⒕道擴(kuò)增產(chǎn)物電⒕結(jié)果大小約為1500bp，回收PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序驗(yàn)證擴(kuò)增基因的序列，結(jié)果見圖3。

圖3 pMD19-T-INU1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification products of pMD19-T-INU1

由圖3可知，1、2⒕道中PCR產(chǎn)物大小約為1 500 bp，與已知菊粉酶基因大小相似，基本判定菊粉酶基因已經(jīng)被連接到pMD19-T中，為了進(jìn)一步確定還需進(jìn)行測序進(jìn)驗(yàn)證，測序結(jié)果與已知基因比對結(jié)果一致，可以用于菊粉酶基因重質(zhì)粒的構(gòu)建。

切膠回收pMD19-T-INU1中的菊粉酶基因片段，用限制性內(nèi)切酶SfiI與BamHI對pINA1317進(jìn)行雙酶，T4連接酶將帶有粘性末端A的菊粉酶基因與酶切后的pINA1317質(zhì)粒片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，挑取含有菊粉酶基因的陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后進(jìn)行SfiI與BamHI雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖4。

圖4 pINA1317-INU1雙酶切電⒕條帶Fig.4 Double-enzyme cutting electrophoretic bands of pINA1317-INU1

由圖4可知，pINA1317-INU1經(jīng)雙酶切結(jié)果分為上下兩條電⒕帶，上面大片段5300bp，為pINA1317，下面小片段大小為1 500 bp，為菊粉酶基因，菊粉酶基因已經(jīng)在表達(dá)質(zhì)粒pINA1317-INU1中構(gòu)建成功，可以進(jìn)行Y.lipolyticaACA-DC酵母轉(zhuǎn)化。

2.2 pINA1317-INU1轉(zhuǎn)化片段制備

用Not I酶切pINA1317-INU1，回收酶切的DNA片段進(jìn)行電⒕檢測，結(jié)果見圖5。

圖5 SfiI和BamHI酶切pINA1317-INU1回收條帶Fig.5 Recovered bands fromSfiI andBamHI digestion of pINA1317-INU1

由圖5可知，大片段是含有菊粉酶基因的DNA序列，小片段是pINA1317質(zhì)粒片段，小片段約2 210 bp左右，大片段約4 700 bp，由pINA1317質(zhì)粒圖譜大小和酶切位點(diǎn)可知大片段的是包含INU1基因的待轉(zhuǎn)化片段，回收線性化大片段，用于尿嘧啶油脂突變株的轉(zhuǎn)化。

2.3 Y.lipolyticaACA-DC尿嘧啶突變株的篩選

將菌株Y.lipolyticaACA-DC劃線接種到含有尿嘧啶的培養(yǎng)基和不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選[19]，結(jié)果如圖6所示。

圖6 尿嘧啶缺陷型解脂亞羅威亞酵母突變株的篩選結(jié)果Fig.6 Screening results of uracil defectiveY.lipolyticawith uracil deficiency

由圖6可知，Y.lipolyticaACA-DC經(jīng)過誘變篩選，突變株能夠在含有尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長，而在不含尿嘧啶的對照培養(yǎng)基中則不能生長，表明獲得尿嘧啶缺陷型的Y.lipolyticaACA-D，可用于菊粉酶基因的表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)化子篩選[19，22]

采用NotI酶切pINA1317-INU1轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，電⒕回收純化分離大片段轉(zhuǎn)化的尿嘧啶突變菌株Y.lipolytica缺陷型，轉(zhuǎn)化成功的菌株以字母C命名轉(zhuǎn)化子，對菊粉酶酶活超過25 U/mL以上的4菌株進(jìn)行命名并保存，結(jié)果如表1所示。

表1 轉(zhuǎn)化子中菊粉酶酶活測定結(jié)果Table 1 Determination results of inulinase activity of the transformants

由表1可知，轉(zhuǎn)化子C37、C95菊粉酶活相對較高，超過30 U/mL，以不含菊粉酶基因的野生菌株為對照，野生型酶活為0，證明菊粉酶基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)化子中成功表達(dá)，其中轉(zhuǎn)化子C37酶活最高，達(dá)到（37.15±0.40）U/mL。

2.5 2 L發(fā)酵罐中菌株發(fā)酵產(chǎn)單細(xì)胞油脂

在2L發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)化子C37生長和產(chǎn)油情況如表2所示。

表2 以菊粉為主要碳源的培養(yǎng)基上菌體生長、油脂產(chǎn)量Table 2 Cells growth and oil yield in the medium with inulin as main carbon source

由表2可知，在2L發(fā)酵罐中，以菊粉為主要碳源的培養(yǎng)基上，經(jīng)過分批發(fā)酵80 h，細(xì)胞干質(zhì)量和油脂產(chǎn)量分別為14.12g/L、49.23%。野生型解脂亞羅威亞酵母菌株在甘油和動(dòng)物油脂為主要營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵時(shí)細(xì)胞干質(zhì)量為9～12g/L[9，22]，油脂產(chǎn)量在44%～54%[22]，生物量和油脂積累量表明轉(zhuǎn)化子C37與野生型原始菌株相比均有提高，轉(zhuǎn)化子C37能夠利用來源更為充足的菊粉、菊糖為碳源進(jìn)行油脂生產(chǎn)。

2.6 油脂的脂肪酸組分測定

收集轉(zhuǎn)化子C37細(xì)胞，105℃干燥恒質(zhì)量后制備菌粉，通過索氏提取方法進(jìn)行細(xì)胞油脂提取，采用氣相色譜儀分析油脂中脂肪酸的組成[22]，結(jié)果如表3所示。

表3 轉(zhuǎn)化子C37所產(chǎn)油脂中脂肪酸組分分析Table 3 Component analysis of fatty acids in oil produced by transformant C37

由表3可知，棕櫚酸、⒉脂酸和油酸3種脂肪酸總和超過92%以上，菌株C37發(fā)酵積累合成的油脂中6種脂肪酸與文獻(xiàn)[22]中報(bào)道的油脂酵母的脂肪酸相似。前期研究發(fā)現(xiàn)，在膠紅酵母TJY15a在菊Ⅲ的提取物上培養(yǎng)時(shí)，棕櫚酸、⒉脂酸和油酸3者含量之和超過87.6%[22]；另外研究還發(fā)現(xiàn)膠紅酵母TJY15a在淀粉水解物上生長時(shí)，三種脂肪酸超過85.8%，其中油酸占63.5%。本研究結(jié)果中油酸產(chǎn)量占59.29%，表明轉(zhuǎn)化子C37與其他油脂酵母含有的脂肪酸非常相似[23-25]。這意味著轉(zhuǎn)化子C37產(chǎn)生油脂是一種很好的生物油脂材料。

3 結(jié)論

為了將菊粉酶基因克隆到油脂酵母中，實(shí)現(xiàn)解脂亞羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）產(chǎn)酶，產(chǎn)油同時(shí)進(jìn)行，本研究通過對解脂亞羅威亞酵母ACA-DC進(jìn)行基因改造，獲得含有菊粉酶基因的轉(zhuǎn)化子C37，經(jīng)過培養(yǎng)，菊粉酶酶活達(dá)到37.15U/mL。脂肪酸分析顯示棕櫚酸、亞油酸和油酸占總脂肪酸的92%以上，尤其是油酸含量高達(dá)59%，表明通過菊粉酶基因在油脂酵母中的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了以菊粉為底物一步發(fā)酵產(chǎn)單細(xì)胞油脂，為綜合開發(fā)利用單細(xì)胞油脂提供了新的途徑，也為油脂中多種脂肪酸的開發(fā)和利用奠定了原料基礎(chǔ)。

[1]HELWANI Z,OTHMAN M R,AZIZ N,et al.Technologies for production of biodiesel focusing on green catalytic techniques:A review[J].Fuel Proc Technol,2009,90（12）:1502-1514.

[2]ZHANG X H,ZHANG Q,WANG T J,et al.Efficient upgrading process for production of low quality fuel from bio-oil[J].Fuel,2016,179:312-321.

[3]PAPANIKOLAOU S,KOMAITIS M,AGGELIS G.Single cell oil（SCO）production byMortierella isabellinagrown on high-sugar content media[J].Bioresour Technol,2004,95（3）:287-291.

[4]PAPANIKOLAOU S,SARANTOU S,KOMAITIS M,et al.Repression of reserve lipid turn over inCunninghamella echinulataandMortierella isabellinacultivated in multiple limited media[J].Appl Microbiol,2004,97（4）:867-875.

[5]PAPANIKOLAOU S,CHEVALOT I,GALIOTOU-PANAYOTOU M,et al.Industrial derivative of tallow:a promising renewable substrate form microbial lipid,single-cell protein and lipase production byYarrowia lipolytica[J].Electron J Biotechnol,2007,10（3）:1-11.

[6]MENG X,YANG J,XU X,et al.Biodiesel production from oleaginous microorganisms[J].Renew Energ,2009,34（1）:1-5.

[7]PAPANIKOLAOU S,AGGELIS G.Biotechnological valorization of biodiesel derived glycerol waste through production of single cell oil and citric acid byYarrowia lipolytica[J].Lipid Technol,2009,21（4）:83-87.

[8]CHUN H Z,CHI Z,ZHANG F,et al.Direct conversion of inulin and extract of tubers ofJerusalem artichokeinto single cell oil by co-cultures of Rhodotorula mucilaginosaTJY15a and immobilized inulinase-producing yeast cells[J].Bioresource Technol,2011,102（10）:6128-6133.

[9]CHAO H,CHEN X F,LIAN X,et al.Single cell oil production from low-cost substrates:The possibility and potential of its industrialization[J].Biotechnol Adv,2013,31（2）:129-139.

[10]CAZETTA M L,MARTINS P M M,MONTI R,et al.Yacon（Polymnia sanchifolia）extract asa substrate to produce inulinase byKluyveromyces marxianusvar.bulgaricus[J].J Food Eng,2005,66（3）:301-305

[11]VIEIRA J P F,IENCZAK J L,COSTA P S,et al.Single cell oil production integrated to a sugarcane-mill:Conceptual design,process specifications and economic analysis using molasses as raw material[J].Ori Ind Crop Prod,2016,89:478-485.

[12]HAO F,CHEN Z,SHAO L C.Single cell oil production byMortierella isabellinafrom steam exploded corn stover degraded by three-stage enzymatic hydrolysis in the context of on-site enzyme production[J].Bioresource Technol,2016,216:988-995.

[13]PROBST K V,VADLANI P V.Production of single cell oil from Lipomyces starkeyiATCC 56304 using biorefinery by-products[J].Bioresource Technol,2015,198:268-275.

[14]QI S,LIN H,WANG Q,et al.Sweetpotato vines hydrolysate promotes single cell oils production ofTrichosporon fermentansin high-density molasses fermentation[J].Bioresource Technol,2015,176:249-256.

[15]DONOT F,FONTANA A,BACCOU J.C,et al.Single cell oils （SCOs）from oleaginous yeasts and moulds:production and genetics[J].Biomass Bioenerg,2014,68（5）:135-150.

[16]ZHAN J M,LIN H,QI S,et al.Potential utilization of waste sweet potato vines hydrolysate as a new source for single cell oils production by Trichosporon fermentans[J].Bioresource Technol,2013,135（10）:622-629.

[17]ADAM D,PAWE? M,WALDEMAR R.Efficient conversion of crude glycerol from various industrial wastes into single cell oil by yeast Yarrowia lipolytica[J].Bioresource Technol,2016,207:237-243.

[18]PIVETTA M R,NOVELLI P K,FLEURI L F.Inulinase activity of soybean and yacon meal fermented withAspergillus niger[J].New Biotechnol,2016,33（3）:425.

[19]ZHANG T,GONG F Z,LIU G.Cloning and characterization of the inulinase gene from a marine yeastPichia guilliermondiiand its expression inPichia pastoris[J].Anton Leeuw,2009,95（1）:13-22.

[20]WANG C L,LI Y,XIN F H,et al.Evaluation of single cell oil fromAureobasidium pullulansvar.melanogenum P10 isolated from mangrove ecosystems for biodiesel production[J].Process Biochem,2014,49（5）:725-731.

[21]ZHANG T,GONG F,CHI Z,et al.Cloning and characterization of the inulinase gene from amarine yeastPichia guilliermondiiand its expression inPichia pastoris[J].Anton Leeuw,2009,95（1）:13-22.

[22]ZHAO C H,ZHANG T,LI M,et al.Single cell oil production from hydrolysate of inulin and extract of tubers of Jerusalem artichoke by RhodotorulamucilaginosaTJY15a[J].Proc Biochem,2010,45（7）:1121-1126.

[23]CARLOS R S,CARLOS J D,VANETE T S,et al.Pilot scale biodiesel production from microbial oil ofRhodosporidium toruloidesDEBB 5533 using sugarcane juice:Performance in diesel engine and preliminary economic study[J].Bioresource Technol,2017,223:259-268.

[24]CARVALHO A K F,RIVALDI J D,BARBOSA J C,et al.Biosynthesis characterization and enzymatic transesterification of single cell oil of Mucor circinelloides-A sustainable pathway for biofuel production[J].Bioresource Technol,2015,181:47-53.

[25]NEEVA B,JI Q,PATRICKK A,et al.Direct fast pyrolysis bio-oil fuel cell[J].Fuel,2016,185:85-93.

Cloning and expression of inulinase gene and analysis of oil components

ZHAO Chunhai1,WANG Zhipeng2,CHI Zhenming3
（1.College of Bioscience Engineering,Binzhou Polytechnic,Binzhou 256603,China;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China;3.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266000,China）

In order to realize oil production directly from inulin byYarrowia lipolytica,exoinulinase geneINU1was connected with expression plasmid pINA1317 and expressed in mutant strainY.lipolyticaACA-DC with uracil deficiency.With uracil deficiency as selection marker,transformant C37 was obtained and the inulase activity was up to 37.15 U/ml by culture.In 2 L fermenter,transformant C37 was fermented with inulin as substrate,the oil yield and cell dry mass were 49%and 14 g/L,respectively.The results of fatty acids analysis showed that the total contents of palmitic acid,stearic acid and oleic acid were more than 92%of total fatty acids,and the oleic acid content was up to 59%,which indicated that the one-step fermentation was realized to produce single cell oil with inulin through the expression of the inulinase gene inY.lipolytica.

Yarrowia lipolytica;inulinase;single cell oil;gene expression

Q815

0254-5071（2017）12-0115-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.024

2017-06-15

山東省中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金（博士基金：BS2012SW001）；山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目（J14LE58，J17KA122）；國家自然科學(xué)基金（31500032）

趙春海（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。