海南黑山羊瘤胃液中乳酸菌的分離和鑒定

張萬(wàn)昌，譚海生，楊勁松*，鞠雪莉，李曉雷，趙建國(guó)，李 茂，周漢林

（1.海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737）

海南黑山羊瘤胃液中乳酸菌的分離和鑒定

張萬(wàn)昌1，譚海生1，楊勁松1*，鞠雪莉1，李曉雷1，趙建國(guó)1，李 茂2，周漢林2

（1.海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737）

以海南黑山羊瘤胃液為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行乳酸菌的分離和鑒定，為黑山羊飼料的青貯提供優(yōu)質(zhì)的乳酸菌菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及H2O2酶、糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)對(duì)所分得菌株進(jìn)行初步鑒定，并對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增與測(cè)序。結(jié)果表明從黑山羊胃液中篩選出15株革蘭氏陽(yáng)性、H2O2酶陰性的乳酸菌疑似菌株，除菌株HBG20不能在pH 3.0條件下生長(zhǎng)，其余菌株均能生長(zhǎng)；三株代表菌株HBG11、HBG46和HBG86在低溫5℃和高溫55℃條件以及pH2.5時(shí)均能生長(zhǎng)，同時(shí)在鹽濃度為6.5%時(shí)也能生長(zhǎng)。16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果表明，菌株HBG11與耐久腸球菌（Enterococcus durans）同源性最高，菌株HBG46與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，菌株HBG86與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）同源性最高。

黑山羊瘤胃液；乳酸菌；16S rDNA序列分析

海南黑山羊又稱雷州山羊，是海南省重要的反芻家畜[1]。動(dòng)物的健康狀況是養(yǎng)殖者們最關(guān)心的問(wèn)題，自19世紀(jì)40年代以來(lái)，抗生素在畜禽疾病的防治方面起到了重要作用，但隨著人們健康意識(shí)的提高，抗生素替代品的研發(fā)逐漸被提上日程，以乳酸菌為主要添加劑的微生態(tài)制劑因其無(wú)污染、無(wú)毒副作用和良好的使用效果而慢慢的得到人們的重視[2]。這其中的原理在于動(dòng)物胃腸道微生物與宿主之間有著密切的共生關(guān)系，在諸多方面影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和動(dòng)物的健康[3]。乳酸菌作為動(dòng)物胃腸道中的固有優(yōu)勢(shì)菌群，已作為飼料添加劑應(yīng)用[4]。目前，飼料生產(chǎn)上應(yīng)用的大多數(shù)益生菌株并非來(lái)源于動(dòng)物胃腸道，這些菌株的生態(tài)環(huán)境與動(dòng)物腸道生理環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，動(dòng)物胃腸道內(nèi)的酸性環(huán)境、膽鹽和厭氧環(huán)境在很大程度上制約了許多微生物的生長(zhǎng)。與此相比，源于反芻動(dòng)物胃腸道內(nèi)的微生物經(jīng)過(guò)胃腸道自身的篩選，則能更好地適應(yīng)胃腸道環(huán)境定殖和大量繁殖。

為此，以海南黑山羊瘤胃液為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行乳酸菌的分離、鑒定，旨在篩選出繁殖快、產(chǎn)酸能力好等功能的乳酸菌，為開發(fā)更適合胃腸道內(nèi)生長(zhǎng)的乳酸菌，為微生態(tài)制劑的菌株提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑山羊胃液：采集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所黑山羊種羊場(chǎng)。瘤胃瘺管安裝手術(shù)后經(jīng)12個(gè)月恢復(fù)健康的羊用于本研究瘤胃液供體。

MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：本課題實(shí)驗(yàn)室配制；氯化鈉、二甲基亞砜（化學(xué)純）：廣州化學(xué)試劑廠；吐溫80、氯仿、丙酮、甲醇、冰醋酸、碳酸鈣（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

GI54DW型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器制造有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3E型精密pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1100型紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；MDF-382E型超低溫冰箱：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

挑選瘺管安裝術(shù)后（12月）健康的黑山羊，打開胃部預(yù)留孔洞，用經(jīng)過(guò)高壓滅菌的勺子掏取胃液于滅菌過(guò)的保溫桶中，并立即帶回實(shí)驗(yàn)室在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌紗布過(guò)濾，之后進(jìn)行梯度稀釋。

1.3.2 乳酸菌的分離純化

選取10-1、10-3、10-5三個(gè)梯度倍數(shù)稀釋，分別用移液槍吸取0.02 mL稀釋液涂布于加有碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h，然后挑選乳白色帶有溶解圈的菌落經(jīng)過(guò)兩次以上劃線分離得到單菌落[5]。

1.3.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)16 h，進(jìn)行革蘭氏染色[6]。

1.3.4 生理生化實(shí)驗(yàn)

（1）過(guò)氧化氫觸酶實(shí)驗(yàn)

用接種環(huán)取單菌落放在滴有3%過(guò)氧化氫的載玻片上，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生[7]。

（2）生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線

按照1%接種量接種到液體MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定pH和分光光度值，繪制生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線[8-9]。

（3）不同溫度、pH、鹽濃度下生長(zhǎng)狀況

將篩選得到的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，分別在5℃、10℃條件下培養(yǎng)10 d，45℃、50℃條件下培養(yǎng)7 d，觀察其生長(zhǎng)狀況。

將MRS液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)整為2.5、3.0、3.5、4.0和7.0，接種后于37℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長(zhǎng)狀況。

向MRS液體培養(yǎng)基中添加3.0%和6.5%的氯化鈉，接種后37℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長(zhǎng)狀況[10-14]。

1.3.5 發(fā)酵液中乳酸的定性分析

將篩選得到的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后4 000 r/min離心5 min，取上清液。采用紙層析法測(cè)定發(fā)酵液中是否含有乳酸。

展開劑為氯仿∶丙酮∶甲醇∶冰醋酸=7∶1∶1.5∶0.8。顯色條件為3%溴甲酚綠酒精指示劑，噴霧后105℃烘箱烘10 min[15]。

1.3.6 16S rDNA測(cè)序分析

本試驗(yàn)分離得到的乳酸菌委托華大基因進(jìn)行測(cè)序，將所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中己知的16S rDNA序列進(jìn)行相似性分析。 16S rDNA 擴(kuò)增序列為：（27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT）5′xxxxxxxxx 3′和 5′yyyyyyy 3′。

1.3.7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

參照張莉力等[16-20]的方法，從GenBank中選擇近緣菌株的16S r DNA基因序列，應(yīng)用MEGA 5.3軟件進(jìn)行多重比對(duì)，采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.3.8 菌種保藏

對(duì)分離、鑒定得到的保藏菌株進(jìn)行活化后，接種到裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中37℃培養(yǎng)16 h，然后用低速離心機(jī)離心，用移液槍吸取1.0 mL NB培養(yǎng)基與下層的細(xì)胞混勻，再轉(zhuǎn)移到冷凍保藏管中，放入冰箱冷凍室預(yù)凍，最后放入超低溫冰箱長(zhǎng)久保存[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

從海南黑山羊胃液樣品中篩選出15株能在MRS碳酸鈣培養(yǎng)基上形成溶鈣圈的疑似乳酸菌菌株，記錄15株菌株的形態(tài)特征。由表1可以看出，只有菌株HBG11有球狀的菌體形態(tài)出現(xiàn)，菌株HBG2、HBG18、HBG20、HBG21、HBG24、HBG26、HBG46、HBG49和HBG56（9株菌）在菌落形態(tài)、菌落大小、菌落顏色和菌體形態(tài)上相似，菌株HBG22、HBG38、HBG43、HBG44和HBG86（5株菌）在菌落形態(tài)、菌落大小、菌落顏色和菌體形態(tài)上相似。

表1 15株黑山羊瘤胃液菌株的菌落及菌株特征Table 1 Morphological and characteristics of the 15 strains isolated from rumen fluid

2.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，15株菌均為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶觸陰性菌，發(fā)酵葡萄糖均不產(chǎn)氣，菌株HBG11發(fā)酵結(jié)束后pH為3.68，選作代表菌株；菌株HBG2、HBG18、HBG20、HBG21、HBG24、HBG26、HBG46、HBG49和HBG56發(fā)酵結(jié)束后pH在3.65左右，結(jié)合表1各株菌的形態(tài)特征選擇菌株HBG46為代表菌株；菌株HBG22、HBG38、HBG43、HBG44和HBG86發(fā)酵結(jié)束后pH在3.79左右，結(jié)合表1各株菌的形態(tài)特征選擇菌株HBG86為代表菌株。多數(shù)菌株在pH2.5或50℃時(shí)都不能生長(zhǎng)。在耐酸性試驗(yàn)中隨著pH值的增加菌種生長(zhǎng)狀況逐漸變好，pH7.0時(shí)生長(zhǎng)狀況最好；在溫度耐受性實(shí)驗(yàn)中，5℃時(shí)的生長(zhǎng)狀況要普遍好于50℃時(shí)的生長(zhǎng)狀況。而在鹽耐受性試驗(yàn)中，15株菌株在含鹽量為3.0%時(shí)的生長(zhǎng)狀況要好于含鹽量為6.5%NaCl時(shí)的生長(zhǎng)狀況。除菌株HBG20不能在pH 3.0的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其余菌株均能生長(zhǎng)。

表2 15株黑山羊瘤胃液菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical tests results of 15 strains isolated from rumen fluid

2.3 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線

乳酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸速度是乳酸菌活力良好的重要特征之一[22]。代表菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線分別如圖1、2所示。

由圖1、圖2可知，3株菌很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)產(chǎn)酸量也相應(yīng)增加，pH值迅速下降；14 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，pH值降低緩慢。20 h后3株菌HBG11、HBG46、HBG86的最終pH值分別為3.68、3.61、3.77。

圖1 代表菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of representative strains

圖2 代表菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.2 Acid production curves of representative strains

2.4 發(fā)酵液中乳酸的定性分析

由圖3可知，通過(guò)紙層析法對(duì)乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和各菌株的發(fā)酵液進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的比稱值（Rf值）為0.809；菌株HBG11、HHBG46和HBG86發(fā)酵液的的平均Rf值分別為0.801、0.813、0.806。 結(jié)果表明，三菌株發(fā)酵液中均含有乳酸，即菌株HBG11、HHBG46和HBG86均能產(chǎn)乳酸。

圖3 乳酸紙層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of lactic acid paper chromatography tests

2.5 16S rDNA測(cè)序分析

將所選取的菌株經(jīng)DNA提取、16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序后，將序列結(jié)果登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果見表3。由表3可知，菌株HBG11和耐久腸球菌（Enterococcus durans）同源性最高，菌株HBG46和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，菌株HBG86和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）同源性最高。所有菌種的同源性均達(dá)到99%以上，和標(biāo)準(zhǔn)菌株序列覆蓋率均達(dá)到99%以上。

表3 黑山羊瘤胃典型菌株的16S rDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果Table 3 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences of the typical isolates from rumen fluid of Hainan black goat

圖4 利用16S rDNA序列對(duì)乳酸桿菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequences

菌株HBG11、HBG46及HBG86根據(jù)16S rDNA序列同源性對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株HBG11鑒定為耐久腸球菌（Enterococcus durans），菌株HBG46鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株HBG86鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

3 結(jié)論

從海南黑山羊胃液中篩選得到15株乳酸菌，生理生化實(shí)驗(yàn)和16SrDNA測(cè)試將其鑒定到種的水平。其中植物乳桿菌（L.plantarum）占60.0%，干酪乳桿菌（L.casei）占33.3%，耐久腸球菌（E.durans）占6.7%。

除菌株HBG20不能在pH 3.0 MRS條件生長(zhǎng)，其余菌株均能生長(zhǎng)；菌株HBG11、HBG46和HBG86在低溫5℃和高溫55℃以及pH2.5時(shí)均能生長(zhǎng)，同時(shí)在鹽濃度為3.0%和6.5%時(shí)也能生長(zhǎng)。將菌株HBG11、HBG46和HBG86進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增與測(cè)序，鑒定菌株HBG11為耐久腸球菌（E.durans），菌株HBG46為植物乳桿菌（L.plantarum），菌株HBG86為干酪乳桿菌（L.casei）。

反芻動(dòng)物在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的胃腸道微生物系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的選擇和適應(yīng)，定植于胃腸道的微生物與宿主之間以及微生物之間形成了一種相互制約、相互依賴的動(dòng)態(tài)平衡。這種平衡對(duì)于維持反芻動(dòng)物的機(jī)體健康、提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能具有重要的營(yíng)養(yǎng)和生理作用。細(xì)菌在微生物發(fā)酵的各個(gè)方面都扮演著重要的角色。植物乳桿菌和乳酪桿菌是胃腸道的益生菌，在腸道內(nèi)能形成正常菌群并產(chǎn)生短鏈脂肪酸，使腸道酸度增加，從而抑制腸道內(nèi)不耐酸病原菌的繁殖，而且在動(dòng)物腸道內(nèi)還可產(chǎn)生細(xì)菌素、類細(xì)菌素、過(guò)氧化氫和某些有機(jī)酸等，并可黏附于腸道細(xì)胞上，產(chǎn)生占位性競(jìng)爭(zhēng)和營(yíng)養(yǎng)性競(jìng)爭(zhēng)作用[23]。本研究結(jié)果表明，海南黑山羊瘤胃液中的植物桿菌和乳酪桿菌，在數(shù)量上占多數(shù)。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria from rumen fluid of Hainan black goat

ZHANG Wanchang1,TAN Haisheng1,YANG Jinsong1*,JU Xueli1,LI Xiaolei1,ZHAO Jianguo1,LI Mao2,ZHOU Hanlin2
（1.College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Tropical Crops Genetic Resources Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agriclutural Sciences,Danzhou 571737,China）

Using rumen fluid of Hainan black goat as research object,the lactic acid bacteria was isolated and identified,in order to provide high quality lactic acid bacteria for the black goat feed silage.The isolated strains were preliminarily identified and characterized by morphological observation,catalase,sugar fermentation and other physiological and biochemical tests,and then the isolated strains were identified by 16S rDNA gene amplification and sequence analysis.There were 15 Gram-positive,catalase-negative strains isolated from the rumen fluid of Hainan black goat in the experiment.Except for strain HBG20,other strains can grow at pH 3.0 condition.Three representative strains HBG11,HBG46 and HBG86 can grow at low temperature 5℃,high temperature 55℃and pH 2.5.Meanwhile,they can tolerate NaCl concentration of 6.5%.16S rDNA gene sequence results showed that three strains HBG11,HBG46 and HBG86 showed the highest homogeneity withEnterococcus durans,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus casei,respectively.

Hainan black goat rumen fluid;lactic acid bacteria;16S rDNA senquence analysis

Q93-331

0254-5071（2017）12-0083-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.017

2017-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31460621）；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（314073）

張萬(wàn)昌（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。

*通訊作者：楊勁松（1966-），教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)、食品微生物學(xué)、農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。