一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及應(yīng)用

韓昱姝，李永轉(zhuǎn)，胡鳳山*，梁麗娟

（山西三盟實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，山西 太原 030032）

一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及應(yīng)用

韓昱姝，李永轉(zhuǎn)，胡鳳山*，梁麗娟

（山西三盟實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，山西 太原 030032）

γ-氨基丁酸是存在于人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)、抗焦慮等功效。以泡菜為原料，利用指示劑變色法和γ-氨基丁酸含量檢測(cè)篩選出7株產(chǎn)γ-氨基丁酸產(chǎn)酸菌，并從中篩選出一株穩(wěn)定性較高菌株，經(jīng)生理生化鑒定和16SrDNA序列分析為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），編號(hào)LF-fb-017。以牛奶為發(fā)酵底物，在溫度37℃，L-谷氨酸鈉濃度為0.5 g/100 mL條件下發(fā)酵3 d，終γ-氨基丁酸產(chǎn)量可達(dá)1.68 mg/mL。

γ-氨基丁酸；短乳桿菌；分離鑒定；牛奶

隨著生活節(jié)奏加快，工作壓力加大，疲勞已成為當(dāng)今人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)（植物如豆屬、藻類、蕨類、蘚類等的種子、組織液和根莖中；動(dòng)物則幾乎只存在于神經(jīng)組織中，濃度最高的區(qū)Ⅱ?yàn)榇竽X中黑質(zhì)，腦組織中含量大約為0.1～0.6 mg/g組織）[1-3]。γ-氨基丁酸具有許多重要的生理功能（如降壓、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)記憶、抗焦慮等），尤其對(duì)更年期的失眠、壓抑和自身失調(diào)療效良好。我國衛(wèi)生部于2009年9月正式批準(zhǔn)γ-氨基丁酸為新資源食品。隨著γ-氨基丁酸生理功能的不斷研究和闡明，目前已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的功能因子，正逐漸應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)[4-7]。

乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌，有幫助消化、有助于人體腸道的健康等功能，是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌[8]。短乳桿菌是乳酸菌中一種，目前已有多篇報(bào)道短乳桿菌能夠高產(chǎn)γ-氨基丁酸[9-13]。因此，利用乳酸菌生產(chǎn)的GABA能達(dá)到食品安全級(jí)，并可進(jìn)一步豐富乳酸菌作為益生菌的保健功效，應(yīng)用前景廣闊[14]。

牛奶是最天然的飲料之一，營養(yǎng)豐富，含有豐富的礦物質(zhì)和必需氨基酸，牛奶中所含的鈣質(zhì)與L-色氨酸能產(chǎn)生誘發(fā)睡眠的荷爾蒙5-羥色胺與褪黑激素，有效助眠，與γ-氨基丁酸的功效相得益彰[15]。本試驗(yàn)選用牛奶、谷物等綠色健康食品作為乳酸菌的發(fā)酵底物，開發(fā)一種純天然發(fā)酵的γ-氨基丁酸飲品，以期為γ-氨基丁酸在食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

韓國泡菜、酸白菜：市售；鹽白菜：實(shí)驗(yàn)室自制。

MRS培養(yǎng)基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫-80 1.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水補(bǔ)至1.0 L，pH6.8。

菌種篩選培養(yǎng)基：在MRS固體培養(yǎng)基中添加0.1%溴甲酚綠。

發(fā)酵培養(yǎng)基：①M(fèi)RS液體培養(yǎng)基（對(duì)照）；②牛奶培養(yǎng)基；③脫脂奶粉培養(yǎng)基；④酸奶培養(yǎng)基；⑤馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基⑥；高粱培養(yǎng)基：3%粉碎高粱；⑦大米培養(yǎng)基：3%大米粉；⑧3%粉碎高粱+3%豌豆；⑨3%粉碎高粱+3%黃豆。

L-谷氨酸鈉（食品級(jí)），γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、乙腈（色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基酸衍生試劑（鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorenylmethylchloroformate，F(xiàn)MOC））：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)股份有限公司；DH-500A型電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UV5100型分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種篩選

檢測(cè)3種泡菜汁中γ-氨基丁酸含量，選擇含量較高的泡菜汁，從中篩選高γ-氨基丁酸乳酸菌菌株。取泡菜汁2 mL，于無菌的MRS液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)48 h，富集菌種。將富集后菌種發(fā)酵液用無菌生理鹽水稀釋至10-12，吸取1 mL至無菌平皿中，傾注法倒平板，37℃倒置培養(yǎng)48 h。

1.3.2 高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種的分離純化

從平板上的雜菌中挑選使溴甲酚綠變黃的菌株，在MRS固體平板上劃線培養(yǎng)，直至培養(yǎng)出菌落形態(tài)單一的純菌種為止。

1.3.3 高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種鑒定

將菌株37℃培養(yǎng)48 h后收集菌體，送北京中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測(cè)中心進(jìn)行菌種鑒定，包括生理生化鑒定，DNA序列分析，并應(yīng)用MEGA5.0軟件與相關(guān)種的16S rDNA序列進(jìn)行多次重復(fù)比對(duì)計(jì)算。

1.3.4 高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種培養(yǎng)基選擇

以2%的接種量接入1.1部分的培養(yǎng)基篩選出的高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種，37℃靜置培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以γ-氨基丁酸產(chǎn)量為衡量指標(biāo)，設(shè)置發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、γ-氨基丁酸底物質(zhì)量濃度（L-谷氨酸鈉）（0.1 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.5 g/100 mL、0.7 g/100 mL、1.0 g/100 mL）的單因素試驗(yàn)，考察發(fā)酵時(shí)間、γ-氨基丁酸底物質(zhì)量濃度對(duì)飲品中γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響。

1.3.6 測(cè)定方法

將發(fā)酵液樣品充分混勻后，取適量于離心杯中，5000r/min離心10min，取上清液。將上清液經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾。色譜條件為：色譜柱為ZorbaxEclipse-AAA氨基酸分析柱；流動(dòng)相A為40mmol/L NaH2PO4，調(diào)節(jié)pH為7.8；流動(dòng)相B為甲醇、乙腈和水，混合比例為45∶45∶10；流速為2 mL/min；進(jìn)樣量為0.5 μL；柱溫為40℃；檢測(cè)波長為338 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩

表1 泡菜樣品中γ-氨基丁酸含量Table 1 γ-aminobutyric acid contents in pickle samples

由表1可知，韓國泡菜中γ-氨基丁酸含量最高，為0.728 mg/mL。因此從韓國泡菜中篩選高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株。

利用含有溴甲酚綠指示劑的MRS固體培養(yǎng)基共篩得變色圈較大的產(chǎn)酸菌株31株，在MRS液態(tài)培養(yǎng)基中分別對(duì)其進(jìn)行單菌種培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量，結(jié)果見表2。

表2 產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株初篩結(jié)果Table 2 Preliminary screening results of strains producing γ-aminobutyric acid

由表2可知，可得到7株產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株，其中僅1株為革蘭氏陰性菌，剩余6株均為革蘭氏陽性，且菌落形態(tài)與鏡檢形態(tài)都較為相似，僅γ-氨基丁酸含量有差異。

2.2 菌種鑒定

對(duì)上述篩得的6株革蘭氏陽性菌株經(jīng)3～5次繼代培養(yǎng)后，選擇其中一株穩(wěn)定性較好且γ-氨基丁酸含量較高的菌株H-3，分離純化后，收集菌體，進(jìn)行菌落形態(tài)鑒定及鏡檢測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。生理生化分析結(jié)果和16S rDNA基因序列分析結(jié)果如表3所示。與相關(guān)種的16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖 1菌株LF-fb-017菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig．1 Colony （A）and cell（B）morphology of strain LF-fb-017

由圖1可知，該菌株菌落呈乳白色，圓形，表面光滑，濕潤，凸起，半透明，邊緣整齊；菌體呈桿狀，大小為（0.4～0.5）μm×（0.8～2.1）μm，單個(gè)或成對(duì)排列，革蘭氏陽性。

表3 菌種LF-fb-017生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LF-fb-017

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

由表3、圖2可知，該菌種與安全等級(jí)為1級(jí)的模式短乳桿菌ATCC 14869相似度100%，將該菌種鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），編號(hào)LF-fb-017。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

將LF-fb-017菌種種子液按照2%的添加量分別加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基①～⑨中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d后，檢測(cè)發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量，結(jié)果見表4。

表4 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響Table 4 Effects of different fermentation media on γ-aminobutyric acid content

由表4可知，該乳酸菌在MRS培養(yǎng)基、牛奶培養(yǎng)基和脫脂奶粉培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)可產(chǎn)生較高γ-氨基丁酸（分別為2.119 mg/mL、0.765 mg/mL、0.903 mg/mL），在牛奶與脫脂奶粉培養(yǎng)基中γ-氨基丁酸含量低于MRS培養(yǎng)基，猜測(cè)可能是由于該培養(yǎng)基中缺乏碳源導(dǎo)致，因此向上述兩種培養(yǎng)基中補(bǔ)加碳源。谷物培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)生γ-氨基丁酸，可能是由于復(fù)配谷物中仍缺乏乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸所必需營養(yǎng)因子，還有待繼續(xù)研究[16]。

牛奶培養(yǎng)基中葡萄糖添加量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響如圖3所示，脫脂奶粉培養(yǎng)基中葡糖糖添加量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響如圖4所示。

圖3 牛奶培養(yǎng)基中葡萄糖添加量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響Fig.3 Effect of glucose addition in milk medium on γ-aminobutyric acid content

圖4 脫脂奶粉培養(yǎng)基中葡糖糖添加量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響Fig.4 Effect of glucose addition in the skimmed milk powder medium on γ-aminobutyric acid content

由圖3、圖4可知，葡萄糖添加量為1%時(shí)，兩種發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量基本達(dá)到最大值，之后隨著葡萄糖添加量增加，γ-氨基丁酸含量趨于平緩或增加緩慢，因此可確定上述兩種培養(yǎng)基中最適葡萄糖添加量為1%。對(duì)比圖3、圖4可發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖后牛奶培養(yǎng)基中γ-氨基丁酸含量增幅較大，最大值達(dá)到1.682 mg/mL，高于脫脂奶粉培養(yǎng)基中的最大值（1.372 mg/mL），因此選擇含有1%葡萄糖的牛奶培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

該菌種的發(fā)酵過程共4個(gè)影響因素：發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、γ-氨基丁酸底物質(zhì)量濃度、發(fā)酵液pH值。其中發(fā)酵溫度由菌株LF-fb-017的最適溫度決定，為37℃；為確保牛奶的營養(yǎng)價(jià)值以及成分不被破壞，pH為牛奶固有pH值，不做改變。

2.4.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響Fig.5 Effects of different fermentation times on γ-aminobutyric acid content

由圖5可知，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響較大，前2dγ-氨基丁酸含量激增，在第2天即可達(dá)到1.2mg/mL以上，但第3天增長緩慢，達(dá)到最大值1.653mg/mL，第4天開始下降，這可能是由于γ-氨基丁酸在第4天時(shí)消耗量大于產(chǎn)生量，導(dǎo)致含量下降。因此，選擇3d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.4.2 不同L-谷氨酸鈉含量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

圖6 不同L-谷氨酸鈉含量對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響Fig.6 Effects of different L-glutamate concentrations on γ-aminobutyric acid content

由圖6可知，不同L-谷氨酸鈉含量對(duì)γ-氨基丁酸含量有一定的影響，當(dāng)L-谷氨酸鈉含量較低時(shí)，γ-氨基丁酸含量隨L-谷氨酸鈉含量的增加而增加；當(dāng)L-谷氨酸鈉含量達(dá)到一定值（0.5 g/100 mL）時(shí)，γ-氨基丁酸含量變化較小，這可能是由于發(fā)酵液中其他因素限制了短乳桿菌對(duì)L-谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化。因此，選擇0.5 g/100 mL為最適底物質(zhì)量濃度。

3 結(jié)論

本研究以泡菜為原料，篩選出7株產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株，并從中篩選出一株穩(wěn)定性較高菌株，經(jīng)鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），編號(hào)LF-fb-017。 該菌株在MRS液體培養(yǎng)基中可產(chǎn)生γ-氨基丁酸2.119 mg/mL，以牛奶為發(fā)酵底物，在溫度37℃，γ-氨基丁酸底物濃度為0.5 g/100 mL的條件下發(fā)酵3 d，γ-氨基丁酸終產(chǎn)量可達(dá)1.682 mg/mL。

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Screening and application of lactic acid bacteria with a high yield γ-aminobutyric acid

HAN Yushu,LI Yongzhuan,HU Fengshan*,LIANG Lijuan
（Shanxi Three-League Industrial Development Co.,Ltd.,Taiyuan 030032,China）

γ-aminobutyric acid is an important inhibitory neurotransmitter in the central nervous system of human,with the effects of nerves sedative,anxiolytic and so on.In this study,7 γ-aminobutyric acid-producing strains were screened from pickle by using indicator color change method and detection of γ-aminobutyric acid content.A strain with high stability was screened out and identified by physiological biochemical tests and 16S rDNA sequencing asLactobacillus brevisLF-fb-017.Using milk as fermentation substrate,the γ-aminobutyric production was 1.68 mg/ml at the conditions of temperature 37℃,L-glutamate 0.5 g/100 ml and fermentation time 3 d.

γ-aminobutyric acid;Lactobacillus brevis;isolation and identification;milk

TS201.3

0254-5071（2017）12-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.015

2017-10-09

山西三盟實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司專項(xiàng)基金（2016）

韓昱姝（1989-），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇l(fā)酵工程。

*通訊作者：胡鳳山（1965-），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇l(fā)酵工程。