紫色紅曲霉FBKL3.0018液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素條件的優(yōu)化研究

王 艷，邱樹毅，王 嘯，胡 娜，唐佳代，吳鑫⒈*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

紫色紅曲霉FBKL3.0018液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素條件的優(yōu)化研究

王 艷1，2，邱樹毅1，2，王 嘯1，2，胡 娜1，2，唐佳代1，2，吳鑫⒈1，2*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

以分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲的紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018為研究對象，以發(fā)酵液中紅曲色素色價為考察指標(biāo)，對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。考察了碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子及初始pH值對紅曲色素生產(chǎn)的影響，選取對紅曲色素生產(chǎn)影響較顯著的蛋白胨、FeSO4和初始pH進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。得到最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5。在此優(yōu)化條件下，紅曲色素色價為105.22 U/mL，比優(yōu)化之前（33.62 U/mL）提高了3.13倍。同時，通過驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際值105.22 U/mL與預(yù)測值108.82 U/mL相對誤差為0.97%，說明所建立的回歸模型可靠。

紫色紅曲霉；紅曲色素；液態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)面法；優(yōu)化

紅曲色素是紅曲霉代謝過程中形成的一系列聚酮類混合物[1]，由黃色素、桔黃色素和紅色素組成，是微生物生產(chǎn)的純天然色素，主要成分有紅曲素、紅曲黃素、紅斑胺、紅曲紅胺、紅斑素及紅曲紅素[2]。紅曲色素具有抑菌和增強(qiáng)免疫力[3]的功效，已成為醫(yī)藥衛(wèi)生[4-5]、防腐保健和食品著色[6-10]、紡織[11-16]等領(lǐng)Ⅱ研究開發(fā)的熱點(diǎn)。

紅曲色素可通過固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵的方法獲得，但傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的方法因生產(chǎn)過程繁雜、得率較低、生產(chǎn)周期長等缺點(diǎn)滿足不了市場需要，嚴(yán)重制約了紅曲色素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[17]。而液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素具有生產(chǎn)安全、穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)，但紅曲色素色價偏低。有學(xué)者通過研究紅曲霉菌的發(fā)酵工藝[18-20]、發(fā)酵條件[21-23]和培養(yǎng)基成分[24-25]來促進(jìn)紅曲色素產(chǎn)量增加。

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲[26]，其來源安全，實(shí)用價值高。本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面分析對其紅曲色素研究，通過考察發(fā)酵培養(yǎng)基組分、生長因子以及初始pH對其產(chǎn)紅曲色素的影響，以期為提高該菌在白酒生產(chǎn)及其他方面的實(shí)用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018：篩選自貴州某濃香型酒廠中溫大曲。

磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、無水氯化鈣（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨：上海博微生物科技有限公司；L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%；無水乙醇：天津市富于精細(xì)化工有限公司；FeSO4：成都金山化學(xué)試劑有限公司；B族維生素：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

斜面培養(yǎng)基采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（malt extract agar，MEA）；種子培養(yǎng)基：麥芽糖40g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO42g/L，pH自然，用蒸餾水配制，121℃濕熱滅菌20 min；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH自然，用蒸餾水配制，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoFisher臺式高速冷凍離心機(jī)：美國ThermoFisher公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；723型可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司制造；PHS-3CpH計：上海鴻蓋儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；ZQPL-200振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

（1）菌種活化

將轉(zhuǎn)接好的菌種斜面放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)活化5～7 d。

（2）種子培養(yǎng)

將活化好的菌種用接種環(huán)刮至裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中，30℃，160 r/min，振蕩1 h，經(jīng)無菌脫脂棉過濾后鏡檢，制成1×107～108個/mL的孢子懸液。接種體積分?jǐn)?shù)9%的接種量將孢子懸液至裝液量為50 mL/250 mL種子培養(yǎng)液中30℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)18 h。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)

接種體積分?jǐn)?shù)9%的種子培養(yǎng)液至裝液量為50 mL/250 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160r/min搖瓶培養(yǎng)96h。

1.3.2 紫色紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)紅曲色素的試驗(yàn)設(shè)計

（1）單因素試驗(yàn)設(shè)計

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過改變碳源（乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖）及碳源質(zhì)量濃度（20g/L、40g/L、60g/L、80 g/L、100 g/L）、氮源（氯化銨、硝酸鈉、蛋白胨、全脂奶粉、脫脂奶粉）及氮源質(zhì)量濃度（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、無機(jī)鹽、生長因子、發(fā)酵液初始pH值，以紅曲色素色價為考察指標(biāo)，對發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果取其均值。

（2）Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計

采用Design-Expert軟件中N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計，以紅曲色素色價（Y，U/mL）響應(yīng)值，對培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子及初始pH進(jìn)行篩選，每個因素設(shè)置+1和-1水平，為了避免遮掩其他因素的重要性，+1水平取-1水平的1.25倍進(jìn)行試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果取其均值。

（3）響應(yīng)面分析法

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果，選取對紅曲色素生產(chǎn)影響較顯著的蛋白胨、FeSO4、初始pH 3個因素為自變量，以紅曲色素色價（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken進(jìn)行中心組合設(shè)計，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果取其均值。

1.3.3 測定方法

色價測定：根據(jù)林元山等[27-28]的色價測定方法改進(jìn)如下，取1 mL發(fā)酵液加入裝有9 mL體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇水溶液的試管中，加塞、搖勻，靜置18 min后，取上清液，用體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇水溶液稀釋250倍數(shù)，體積分?jǐn)?shù)90%乙醇水溶液作對照。采用可見光分光光度計，檢測波長350 nm處黃色素吸光度值、470 nm處橙色素吸光度值和510 nm處紅色素吸光度值。吸光度值乘稀釋倍數(shù)即為發(fā)酵液色價，最后將3組色素色價疊加，即為胞外紅曲色素色價。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對產(chǎn)紅曲色素的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)作對照，考察不同碳源（添加量40g/L）對產(chǎn)紅曲色素的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，相同試驗(yàn)條件下，不同濃度的葡萄糖對紅曲色素產(chǎn)量的影響如圖2所示。

圖1 不同碳源對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

由圖1可知，葡萄糖作為單糖能更快被菌體利用，對紅曲色素分泌影響最大，產(chǎn)物積累最多，紅曲色素色價為41.5 U/mL；其次為蔗糖，紅曲色素色價為37.5 U/mL；可溶性淀粉或乳糖作為碳源時紅曲色素的色價較低，分別為20.5U/mL、15U/mL。

由圖2可知，當(dāng)葡萄糖含量為60 g/L時，紅曲色素色價最高，為45.9 U/mL；其次為葡萄糖含量為40 g/L、80 g/L，紅曲色素色價分別為41.6 U/mL、39.2 U/mL；葡萄糖含量為20g/L、100g/L時紅曲色素的色價較低，分別為26.2 U/mL、27.1 U/mL。

圖2 不同葡萄糖含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.2 Effects of different glucose contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.2 氮源對產(chǎn)紅曲色素的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)作對照，考察不同氮源（添加量2g/L）對紅曲色素產(chǎn)量的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，蛋白胨對紅曲色素影響最大，紅曲色素色價為59.25U/mL。

圖3 不同氮源對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.3 Effects of different nitrogen source on pigment production by M.purpureusFBKL3.0018

相同試驗(yàn)條件下，不同濃度的蛋白胨對紅曲色素產(chǎn)量的影響如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)?shù)鞍纂撕繛?5 g/L時，紅曲色素產(chǎn)量最高，紅曲色素色價為65 U/mL。

圖4 不同蛋白胨含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.4 Effects of different peptone contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.3 無機(jī)鹽對產(chǎn)紅曲色素的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)作對照，考察不同無機(jī)鹽（添加量2g/L）對紅曲色素產(chǎn)量的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，F(xiàn)eSO4對紅曲色素的促進(jìn)作用較為明顯，紅曲色素色價為74.25U/mL。

圖5 不同無機(jī)鹽對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.5 Effects of different mineral salts on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

相同試驗(yàn)條件下，不同濃度的FeSO4對紅曲色素產(chǎn)量的影響如圖6所示。由圖6可知，1g/L的FeSO4對代謝物紅曲色素分泌影響最大，紅曲色素色價為93.75U/mL。

圖6 不同F(xiàn)eSO4含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of different FeSO4contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.4 生長因子對產(chǎn)紅曲色素的影響

圖7 不同生長因子對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.7 Effects of different growth factors on monascus pigment production byM.s purpureusFBKL3.0018

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)作對照，不同生長因子（添加量3g/L）對紅曲色素產(chǎn)量影響結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，L-谷氨酸對紅曲色素的形成影響最大，紅曲色素色價為41.5U/mL。

相同試驗(yàn)條件下，不同濃度的L-谷氨酸對紅曲色素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，L-谷氨酸含量為2g/L條件下，紅曲色素色價最高為44.5 U/mL。

圖8 不同L-谷氨酸含量對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.8 Effects of different L-Glu contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.5 初始pH對產(chǎn)紅曲色素的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對照，不同初始pH對紅曲色素產(chǎn)量影響結(jié)果，如圖9所示。

圖9 不同初始pH值對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的影響Fig.9 Effects of different pH values on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

由圖9可知，不同起始pH對紅曲色素形成的差異較大。當(dāng)發(fā)酵液初始pH 4.8時，紅曲色素產(chǎn)量最大，紅曲色素色價為48.1 U/mL。

2.2 培養(yǎng)基Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表1，各因素主效應(yīng)分析見表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

續(xù)表

表2 Plackett-Burman因素水平及主效應(yīng)分析Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments and main effects analysis

由表2可知，在95%水平以上的影響因素有：蛋白胨、FeSO4、初始pH值。所以本研究選取這3個差異比較顯著的因素進(jìn)行下一階段的響應(yīng)面分析。

2.3 紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

（1）響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及回歸模型方差分析

在Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計和主效應(yīng)分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，中心組合試驗(yàn)設(shè)計因素與水平見表3，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表4。

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計因素與水平Table 3 Factors and levels of central composite design

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

續(xù)表

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

對回歸模型進(jìn)行方差分析，由表5可知，P＜0.01，失擬項(xiàng)P＞F值＞0.05，說明回歸模型極顯著，失擬檢驗(yàn)不顯著，即該模型在所研究區(qū)Ⅱ內(nèi)擬合性較好。

利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計，用Design-Expert 8.06軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到紫色紅曲霉FBKL3.0018所產(chǎn)紅曲色素對蛋白胨（X1）、FeSO4（X2）、初始pH（X3）的擬合回歸方程為：Y=105.54-0.31X1-1.44X2+1X3+1.29X1X2-4X1X3+0.34X2X3-3.28X12-2.99X22-6.21X32。

針對擬合的回歸方程進(jìn)行誤差統(tǒng)計分析，分析結(jié)果見表6。

表6 回歸方程誤差統(tǒng)計分析Table 6 Statistical analysis of regression equations

由表6可知，R2=0.979 3，R2Adj=0.952 8這兩個值高且接近，表明回歸模型足以解釋生產(chǎn)紅曲色素的培養(yǎng)基優(yōu)化過程，能夠解釋97.93%試驗(yàn)所得紅曲色素產(chǎn)量的變化，所以方程擬合較好；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜10%，說明試驗(yàn)可信度強(qiáng)及精確度較高。綜上說明該回歸方程給紫色紅曲霉FBKL3.0018生產(chǎn)紅曲色素提供了一個良好的模型。

（2）相應(yīng)曲面和等高線圖率

根據(jù)回歸方程分別做出兩兩試驗(yàn)因素間交互作用三維立體響應(yīng)曲面圖和等高線如圖10所示，它們分別反⒊了初始pH值、蛋白胨、FeSO4這3個因素間兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響。由回歸方程知，二次項(xiàng)系數(shù)都為負(fù)值，表明所表征的拋物面向下，出現(xiàn)有極大值。采用Design-Expert8.06軟件進(jìn)行分析，得到形成紅曲色素的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為蛋白胨26.2 g/L、FeSO40.9 g/L、初始pH 4.51。

圖10 蛋白胨、初始pH和FeSO4交互作用對紫色紅曲霉FBKL3．0018產(chǎn)紅曲色素影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig．10 Response surface plots and contour line of effects of interaction of peptide，initial pH and FeSO4on monascus pigment production byM．purpureusFBKL3．0018

（3）回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為了方便實(shí)際操作，修改培養(yǎng)基配方為蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、初始pH 4.5。驗(yàn)證響應(yīng)面所建模型的預(yù)測值，用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，3次試驗(yàn)結(jié)果均值為105.22 U/mL，與預(yù)測值108.82 U/mL較接近，相對誤差為0.97%。表明預(yù)測值與實(shí)際值具有較好的擬合性，優(yōu)化模型切實(shí)可靠。同時，優(yōu)化后的紅曲色素色價（105.22 U/mL）是優(yōu)化前（33.62 U/mL）的4.13倍，說明本試驗(yàn)設(shè)計的優(yōu)化方案合理可行，得到的培養(yǎng)基能明顯提高紅曲色素的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計，利用響應(yīng)面對紫色紅曲霉FBKL3.0018產(chǎn)紅曲色素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，建立產(chǎn)紅曲色素回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)證明該模型切實(shí)可行。確定紫色紅曲霉FBKL3.0018代謝產(chǎn)紅曲色素的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5，在此條件下，紅曲色素色價為105.22 U/mL，是優(yōu)化前的4.13倍。

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Optimization of submerged fermentation conditions ofMonascus purpureusFBKL3.0018 for monascus pigment production

WANG Yan1,2,QIU Shuyi1,2,WANG Xiao1,2,HU Na1,2,TANG Jiadai1,2,WU Xinying1,2*
（1.Guizhou Key Lab of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China）

UsingMonascus purpureusFBKL3.0018 isolated from medium temperature Daqu of Guizhou Luzhou-flavor distillery as research object,the monascus pigment color value of fermentation broth as investigation index,the medium formula ofM.purpureusFBKL3.0018 fermentation for pigment production was optimized.The effects of carbon source,nitrogen source,inorganic salt,growth factors and initial pH on the production of monascus pigment were investigated,and the factors（peptone,FeSO4and initial pH）significantly affecting the pigment production were optimized by response surface methodology.Results showed that the optimal medium formula was glucose 60 g/L,peptone 26 g/L,FeSO40.9 g/L,L-Glu 2 g/L and initial pH 4.5.Under the optimized medium,the color value of the monascus pigment was 105.22 U/ml,which was 3.13 times that of before optimization （33.62 U/ml）.At the same time,through validation experiments,the relative error between the actual value （105.22 U/ml）and the predicted value （108.82 U/ml）was 0.97%,which indicated that the established regression model was reliable.

Monascus purpureus;monascus pigment;submerged fermentation;response surface methodology;optimization

TQ929.2

0254-5071（2017）12-0057-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.012

2017-10-09

貴州省科技計劃項(xiàng)目黔科合LH字（【2014】7675）

王 艷（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c發(fā)酵技術(shù)。

*通訊作者：吳鑫⒈（1975-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槊腹こ獭?/p>