IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者發(fā)病及治療中的作用

應伊麗　袁遠

[摘要] 目的 探討IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者的發(fā)病和治療中的作用。 方法 選取2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板減少癥患者和36例來我院體檢的健康人為研究對象，分別為觀察組和對照組，觀察組給予地塞米松40 mg/d進行治療，對照組不采取任何處理。通過液相-質(zhì)譜分析儀檢測血漿中犬尿氨酸（Kyn）和色氨酸（Trp）的濃度；通過流式細胞儀檢測T淋巴細胞中IDO和TTS的表達。 結(jié)果 與對照組相比，治療前免疫性血小板減少癥患者血漿中Kyn、Trp、Kyn/Trp的表達量較高，IDO的表達量較低，而TTS的表達量則明顯較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；觀察組經(jīng)有效治療后，患者血漿中Trp的濃度降低，而Kyn濃度及Kyn/Trp比值則明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；患者IDO表達量明顯上升，而TTS的表達量則明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 地塞米松對免疫性血小板減少癥患者療效顯著，主要通過IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑發(fā)揮作用，臨床可以通過監(jiān)測IDO、TTS的水平指導其治療。

[關(guān)鍵詞] IDO；TTS；免疫性血小板減少癥；發(fā)?。恢委?/p>

[中圖分類號] R593.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）36-0006-04

[Abstract] Objective To investigate the role of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of patients with immune thrombocytopenia. Methods A total of 36 patients with immune thrombocytopenia admitted in our hospital from July 2015 to August 2016 and 36 healthy volunteers who were in our hospital for physical examination were divided into observation group and control group. The observation group was given dexamethasone 40 mg/d. The control group was not given any treatment. Plasma concentrations of Kyn and Tryptophan were measured by liquid chromatography-mass spectrometry. The expression of IDO and TTS in T lymphocytes was detected by flow cytometry. Results Compared with that of the control group， the Kyn， Trp and Kyn/Trp plasma level in patients with pre-immune thrombocytopenia was higher， and the expression of IDO was lower， and the expression of TTS was significantly higher， and the difference was significant（P<0.05）. After effective treatment， the concentration of Trp in the plasma of the observation group was decreased， while the Kyn concentration and Kyn/Trp ratio of the observation group was significantly increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The IDO expression level significantly increased， while the expression of TTS was significantly decreased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Dexamethasone has a significant effect on patients with immune thrombocytopenia. It plays a role mainly through the tryptophan metabolic pathway mediated by IDO/TTS. Dexamethasone can monitor the level of IDO and TTS in order to guide its treatment. Clinically， IDO and TTS levels can be monitored to guide the treatment.

[Key words] IDO； TTS； Immune thrombocytopenia； Incidence； Treatment

免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）又稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，屬于獲得性自身免疫性疾病[1，2]，是由于自身反應性B和T細胞被自身血小板抗原所激活[3]，而發(fā)生免疫介導的單核巨噬細胞系統(tǒng)過度破壞被自身抗體致敏的血小板或免疫介導的巨核細胞抑制血小板的釋放，導致患者產(chǎn)生血小板減少或破壞的免疫性疾病[2，4]，主要表現(xiàn)為血小板減少、皮膚黏膜出血、乏力等癥狀[5]。地塞米松屬于腎上腺糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗過敏、抗病毒的多種功效，主要用于治療嚴重過敏[6]、哮喘、皮膚病和慢性阻塞性肺部疾病[7]、結(jié)核病[8]、免疫性疾病[9，10]，作為治療免疫性血小板減少癥的首選藥物，其臨床有效率可達70%[11]。色氨酸（Trp）是細胞生存和周期進展中的必須氨基酸，T細胞的周期進程對細胞內(nèi)Trp含量很敏感，當Trp濃度降低時，T細胞周期發(fā)生阻滯，T細胞的增殖會發(fā)生抑制[12]。Trp主要沿犬尿氨酸（Kyn）途徑進行分解，吲哚胺2，3-雙加氧酶（indolea-mine2，3-dioxygenase，IDO）是Trp沿上述途徑分解的限速酶和關(guān)鍵酶。Trp-tRNA合成酶（Tryptophanyl- tRNAsynthetase，TTS）屬于胞內(nèi)酶，可以將Trp加載到其自身特異的tRNA上，形成Trp-tRNA的復合物，降低了IDO對Trp的消耗，拮抗其對T細胞增殖的抑制[13]。本研究選擇2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板減少癥患者和來我院體檢的36例健康人為研究對象，探討IDO/ TTS介導的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者的發(fā)病和治療中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 入選標準

符合1994年全國第五屆血栓與止血學術(shù)會議中提出的《ITF診斷標準》：（1）實驗室檢測結(jié)果顯示血小板減少；（2）脾臟輕度或不腫大；（3）脊髓檢查結(jié)果顯示巨核細胞成熟障礙，數(shù)目正?；蛟龆?；（4）至少滿足以下中的一項：①血小板相關(guān)免疫球蛋白（PAIg）數(shù)目增加；②血小板相關(guān)補體3（PAC3）數(shù)目增加；③脾切除治療有效；④激素治療有效；⑤血小板壽命減少。

1.2 排除標準

（1）有其他自身免疫性疾病患者；（2）有嚴重高血壓、糖尿病患者；（3）有消化道潰瘍、肝炎、慢性阻塞性肺疾病等慢性感染性疾病患者；（4）采樣前1個月內(nèi)使用過免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素的患者。

1.3 一般資料

選擇2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板減少癥患者和36例來我院體檢的健康人為研究對象，分別為觀察組和對照組。觀察組男20例，女16例；年齡12～69歲，平均（34.72±6.48）歲；血小板計數(shù)為（1～58）×109/L，平均血小板計數(shù)為（16.82±9.31）×109/L，均符合以上入選標準。對照組均為來我院體檢的健康人，其中男19例，女17例；年齡24～62歲，平均（35.61±3.79）歲；血小板計數(shù)為（143～289）×109/L，平均血小板計數(shù)為（207.84±40.12）×109/L。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.4 治療方法

觀察組給予地塞米松（遂成藥業(yè)股份有限公司，H41021038）進行治療，劑量為40 mg/d，持續(xù)給藥4 d的方案進行治療。對照組不做任何治療性處理。在治療前和治療后第5 d抽取兩組患者肝素抗凝血樣本。

1.5 檢測方法

1.5.1 分離血漿和外周單個核細胞 分別取觀察組患者治療前、治療后5 d及正常對照組經(jīng)肝素抗凝處理后的外周血10 mL，于1000 rpm下離心10 min，將上層富含血小板的血漿吸出置于另外一支離心管中，于3000 rpm下離心5 min，吸取上層血漿保存于-80℃。將下層的細胞層用PBS稀釋。將分離液和稀釋液按2∶1的比例配置淋巴細胞分離液，將血液緩慢輕柔地加入到淋巴細胞分離液中，于800 rpm下離心25 min，吸取中間白膜層，于4℃、600 rpm下離心10 min，棄上清，取下層細胞層，用PBS洗滌，再次于4℃、1000 rpm下離心10 min，棄上清，下層即為外周單個核細胞（PBMCs），用PBS重懸PBMCs，調(diào)整細胞濃度。

1.5.2 液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析檢測血漿中Kyn、Trp濃度 在上述各組100 μL的血漿樣本中加入10 μL的乙腈，渦旋1 min，于14 000 rpm下離心30 min后取上清液進行液相-質(zhì)譜分析。流動相A相：水與乙腈體積比（V/V）為95∶5，其中甲酸含量為0.1%；流動相B相：水與乙腈體積比（V/V）為5∶95，其中甲酸含量為0.1%。以0.2 mL/min的速度進行梯度洗脫。采用外標法進行測定。

1.5.3 流式細胞儀檢測T淋巴細胞CD4+和CD8+中IDO和TTS的表達 用PBS調(diào)整PBMCs濃度為5×105/L，每管加 5 mL CD4+和CD8+抗體，于4℃下孵育30 min，PBS洗滌，加入500 mL 固定液進行固定，PBS洗滌后，將細胞用破壁液進行重懸，于1800 rpm下離心20 min，棄上清。分別加入一抗、二抗進行孵育，加入PBS離心洗滌、重懸，將處理好的樣品放入流式細胞儀進行檢測。

1.6 療效判定標準

（1）完全緩解：臨床癥狀消失，無出血，血小板數(shù)≥100×109/L。（2）有效：臨床癥狀緩解，無出血，血小板數(shù)≥30×109/L且較治療前增加2倍以上。（3）無效：滿足以下之一：①臨床癥狀未得到明顯緩解，仍然有出血的癥狀；②血小板數(shù)<30×109/L；③血小板數(shù)增加未達治療前2倍。符合（1）或（2）的為臨床有效病例，符合（3）的為臨床無效病例。臨床有效率=（完全緩解例數(shù)+有效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%。

1.7統(tǒng)計學方法

應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松療效結(jié)果

36例免疫性血小板減少癥患者經(jīng)大劑量地塞米松治療后，完全緩解12例，有效18例，無效6例，臨床有效率為83.33%。80.00%以上的患者臨床癥狀得到緩解，且無明顯的不良反應。

2.2不同組患者血漿中Kyn、Trp的水平及Kyn/Trp比值比較

與對照組相比，治療前免疫性血小板減少癥患者血漿中Kyn、Trp、Kyn/Trp的表達量較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與治療前相比，觀察組有效治療組中，患者血漿中Trp的濃度降低，而Kyn濃度及Kyn/Trp比值則明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與治療前相比，觀察組無效治療組中，患者血漿中Kyn、Trp水平以及Kyn/Trp比值均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3不同組患者T淋巴細胞CD4+和CD8+中IDO和TTS表達結(jié)果比較

與對照組相比，觀察組治療前免疫性血小板減少癥患者CD4+和CD8+T淋巴細胞中IDO的表達量較低，而CD4+和CD8+T淋巴細胞中TTS的表達量則明顯較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與治療前相比，觀察組有效治療組中，患者CD4+和CD8+T淋巴細胞中IDO表達量明顯上升，而CD4+和CD8+T淋巴細胞中TTS的表達量則明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在觀察組無效組中，患者治療前后血CD4+和CD8+T淋巴細胞中IDO、TTS的水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種由淋巴細胞介導的自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為出血，是臨床上最常見的出血性疾病之一[14，15]。自身免疫性血小板清除的增加、血小板的破壞、血小板生成的減少等打破了正常人體血小板生成與清除間的平衡，而導致患者體內(nèi)血小板數(shù)量減少。早期研究者們認為ITP的發(fā)病主要是由于患者體內(nèi)體液免疫的異常所致，但由于部分患者體內(nèi)未檢測到特異性血小板抗體，如今，研究者們更傾向于認為ITP的發(fā)病主要是由于患者體內(nèi)細胞免疫的異常所致[16]，CD4+T淋巴細胞是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細胞，是啟動和維持自身抗血小板抗體活性的關(guān)鍵，在免疫性血小板減少癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[17]。

糖皮質(zhì)激素是臨床用于治療自身免疫性疾病的首選藥物[18]，其中地塞米松是公認的治療免疫性血小板減少癥的首選藥，一直備受關(guān)注。地塞米松用于治療ITP具有療效顯著、見效快、毒副作用少等優(yōu)點，其主要通過抑制T淋巴細胞的激活，進而抑制自身免疫反應的發(fā)生；降低毛細血管的通透性；B淋巴細胞的分化以及抑制患者體內(nèi)對抗原的吞噬和處理而發(fā)揮其治療作用。但長期大劑量使用地塞米松其毒副作用也會出現(xiàn)。相比于正常人，免疫性血小板減少癥患者體內(nèi)IDO和TTS表達均不同[19]，經(jīng)地塞米松治療后，患者體內(nèi)IDO/TTS代謝的改變值得我們深入研究。

在本研究中，我們選取了2015年7月～2017年8月我院收治的36例免疫性血小板減少癥患者和36例來我院體檢的健康人為研究對象，分為觀察組和對照組，研究組給予地塞米松40 mg/d進行治療，療程為4 d，對照組不采取任何處理，治療前和治療后一周采集經(jīng)肝素抗凝的樣本血。通過液相-質(zhì)譜分析儀檢測血漿中犬尿氨酸（Kyn）和色氨酸 （Trp）的濃度，比較治療前觀察組和對照組以及觀察組治療前后Kyn和Trp表達的不同，分析IDO的活性；通過流式細胞儀檢測T淋巴細胞中IDO和TTS的表達，比較治療前觀察組和對照組以及觀察組治療前后IDO和TTS表達的不同。結(jié)果顯示：與對照組相比，治療前免疫性血小板減少癥患者血漿中Kyn、Trp、Kyn/Trp的表達量較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與治療前相比，觀察組經(jīng)有效治療后，患者血漿中Trp的濃度降低，而Kyn濃度及Kyn/Trp比值則明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組相比，治療前免疫性血小板減少癥患者T淋巴細胞中IDO的表達量較低，而TTS的表達量則明顯較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與治療前相比，觀察組經(jīng)有效治療后，患者T淋巴細胞中IDO表達量明顯上升，而TTS的表達量則明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在無效治療組中，患者治療前后血漿Kyn、Trp、Kyn/Trp、IDO、TTS的水平無明顯變化。

地塞米松對免疫性血小板減少癥患者療效顯著[20]，主要通過IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑而發(fā)揮作用，臨床可以通過監(jiān)測患者體內(nèi)IDO、TTS的水平，從而指導免疫性血小板減少癥的治療，為免疫性血小板減少癥的臨床治療提供一條新思路。

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（收稿日期：2017-10-31）