SPME—GC—MS法測(cè)定小鱷龜肉中關(guān)鍵風(fēng)味化合物的響應(yīng)面法優(yōu)化

張同剛+范玲

摘 要：以小鱷龜肉為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析優(yōu)化小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的萃取條件，采用頂空固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)檢測(cè)并分析小鱷龜肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)結(jié)合化合物的感覺(jué)閾值，利用相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法確定關(guān)鍵風(fēng)味化合物。結(jié)果表明：小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的最佳萃取條件為萃取時(shí)間25 min、萃取溫度60 ℃、樣品添加量1.0 g。在此萃取條件下，從去皮及帶皮小鱷龜肌肉中分別檢測(cè)出33 種和37 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，且關(guān)鍵風(fēng)味化合物種類(lèi)基本相同，主要是D-檸檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等化合物，它們共同決定了小鱷龜肌肉的整體風(fēng)味。

關(guān)鍵詞：小鱷龜肉；響應(yīng)面分析；固相微萃??；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；關(guān)鍵風(fēng)味化合物

Optimization of Solid-Phase Microextraction Conditions by Response Surface Methodology for Gas Chromatography-Mass Spectrometry Determination of Key Flavor Compounds in Chelydra serpentina Muscle

ZHANG Tonggang， FAN Ling*

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： A solid-phase microextraction （SPME） procedure for the determination of volatile compounds in Chelydra serpentina muscle by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was presented. The extraction conditions were optimized using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology. The key flavor compounds were determined by their sensory threshold and relative odor activity value （ROAV）. The results showed that the optimal extraction conditions were determined as follows： extraction time 25 min， extraction temperature 60 ℃ and sampling weight 1.0 g. Under these optimized conditions， a total of 37 and 33 volatile flavor compounds were found in Chelydra serpentina muscle with and without skin， respectively. The key flavor components in both samples were basically the same， mainly including heptyl aldehyde， 3-methyl butanal，3-methylthiopropanal， phenylacetaldehyde，1-octene-3-alcohol， D-limonene， nonanoic acid， hexanal， dimethyl sulfide， （Z）-4-heptenal， and 2-ethyl-furan.

Key words： Chelydra serpentine muscle； response surface methodology； solid phase microextraction； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）； key flavor compounds

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708007

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）08-0034-05

小鱷龜（Chelydra serpentina），又名蛇鱷龜，隸屬爬行綱、龜鱉亞綱、龜鱉目、曲頸龜亞目、鱷龜科、鱷龜屬，原產(chǎn)于北美洲地區(qū)，90年代后期作為寵物龜少量引入我國(guó)[1]。小鱷龜具有抗病能力好、生長(zhǎng)速度較快、體型相對(duì)較大、殼薄肉多等特點(diǎn)，其肉質(zhì)肥美、細(xì)膩、營(yíng)養(yǎng)豐富、無(wú)異味，具有很高的經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值[2]。目前，對(duì)小鱷龜?shù)臏厥茵B(yǎng)殖、人工繁殖、性別決定、餌料偏好等方面已進(jìn)行過(guò)一些研究[3-9]，劉翠娥等[10]研究了小鱷龜?shù)暮饴屎图∪庵械臓I(yíng)養(yǎng)成分，證實(shí)小鱷龜肉是一種高蛋白、低脂肪的優(yōu)質(zhì)肉類(lèi)。但小鱷龜肉風(fēng)味方面的相關(guān)報(bào)道較少。

本研究以人工養(yǎng)殖小鱷龜為研究對(duì)象，采用頂空固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）技術(shù)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)結(jié)合測(cè)定小鱷龜肌肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，首次結(jié)合感覺(jué)閾值，利用相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）[11-14]確定小鱷龜肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分，為小鱷龜肉制品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與研究提供理論參考。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用鱷龜購(gòu)自廣東省順德區(qū)煒杰龜鱉養(yǎng)殖場(chǎng)，共4 只，雌性，二齡龜，體質(zhì)健壯、無(wú)病害，平均體質(zhì)量（3 300±20） g。宰殺取肉，用蒸餾水清洗后分別裝入保鮮袋中，-80 ℃超低溫冰箱速凍保存。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2（2003-61）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭（65 μm） 日本島津公司；HH.SY21-Ni6-C高速組織搗碎機(jī) 江蘇金壇市億通電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇萃取時(shí)間分別為15、20、25、30、35 min（萃取溫度60 ℃，樣品添加量1.0 g），萃取溫度分別為50、55、60、65、70 ℃（萃取時(shí)間25 min，樣品添加量1.0 g），樣品添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g（萃取時(shí)間25 min，萃取溫度60 ℃），研究不同因素對(duì)去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三水平三因素響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取

樣品預(yù)處理：將去皮及帶皮小鱷龜肌肉樣品放入高速組織搗碎機(jī)中制成糜狀，備用。

樣品的SPME：參考文獻(xiàn)[15]中的方法，并稍作修改。將4 g肌肉樣品置于20 mL透明玻璃頂空瓶中，加入0.6 g氯化鈉，混合均勻，80 ℃恒溫水浴15 min；把SPME針頭插入頂空瓶中對(duì)樣品進(jìn)行萃取，15 min之后將萃取纖維頭取出，插入GC-MS儀進(jìn)樣口，脫附3 min后，開(kāi)始檢測(cè)。

1.3.4 樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)

GC條件：參考文獻(xiàn)[15]中的方法，并略作修改。Agilent DB-5MS檢測(cè)柱（30 m×0.25 mm，0.5μm），He為載氣，設(shè)定流速為3.7 mL/min，不分流；進(jìn)樣器溫度250 ℃，氫火焰離子化檢測(cè)器（hydrogen flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度250 ℃，檢測(cè)柱初溫50 ℃，保持2 min，以15 ℃/min的速率升溫至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升溫至210 ℃，保持10 min，之后以10 ℃/min的速率升溫至260 ℃，再以5 ℃/min的速率升溫至280 ℃。

MS條件：GC-MS接口溫度250 ℃，質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍20～450 u[15]。

1.3.5 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV測(cè)定

采用ROAV法，把樣品中對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的ROAV賦值為100（ROAVstan=100），其余風(fēng)味物質(zhì)的ROAV按照下式計(jì)算。

式中：Cri為各組分的相對(duì)含量/%；Ti為各組分的感覺(jué)閾值/（μg/kg）；Crstan為對(duì)樣品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大物質(zhì)的相對(duì)含量/%；Tstan為對(duì)樣品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大物質(zhì)的感覺(jué)閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分含量，采用SPSS 17.0軟件和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，通過(guò)美國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)研究所出版的NIST05a.L質(zhì)譜譜庫(kù)對(duì)化合物定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)

結(jié)合以總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇萃取時(shí)間為20、25、30 min，萃取溫度為55、60、65 ℃，樣品添加量為0.5、1.0、1.5 g，以總峰面積作為響應(yīng)值，進(jìn)行三水平三因素響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平與結(jié)果如表1所示。

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)式回歸模型：Y=-13.67+21.35A+

10.96B-6.52C+3.04AB-0.52AC-6.01×10-3BC+0.58A2-1.03B2-0.27C2。由表2可知，二次多項(xiàng)式回歸模型顯示出極顯著水平（P<0.01），說(shuō)明所得回歸方程與實(shí)際情況的吻合度較好；C、B2和C2對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P<0.01），各因素對(duì)總峰面積影響的大小順序?yàn)檩腿r(shí)間>樣品添加量>萃取溫度。

由圖1可知，當(dāng)萃取時(shí)間為24.86 min、萃取溫度為60.14 ℃時(shí)，去皮小鱷龜肉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積達(dá)到最大值；由圖2可知，當(dāng)萃取時(shí)間為24.86 min、樣品添加量為1.02 g時(shí)，總峰面積達(dá)到最大值；由圖3可知，當(dāng)樣品添加量為1.02 g、萃取溫度為60.14 ℃時(shí)，總峰面積達(dá)到最大值。綜上所述，去皮小鱷龜肉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積達(dá)到最大值時(shí)的萃取條件為萃取時(shí)間24.86 min、萃取溫度60.14 ℃、樣品添加量1.02 g。

2.2.2 模型驗(yàn)證

當(dāng)選取萃取條件為萃取時(shí)間24.86 min、萃取溫度60.14 ℃、樣品添加量1.02 g時(shí)，去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積預(yù)測(cè)值為1.562×106?？紤]到實(shí)驗(yàn)操作的方便性，對(duì)萃取條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，選擇萃取時(shí)間為25 min、萃取溫度為60 ℃、樣品添加量為1.0 g進(jìn)行5 次平行實(shí)驗(yàn)，總峰面積平均值為1.489×106。預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的誤差為1.46%，說(shuō)明本研究得到的小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最佳萃取條件可行性較好。

2.2 小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

在最佳萃取條件下，采用SPME與GC-MS聯(lián)用，得到去皮及帶皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖，如圖4～5所示。其中去皮小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總峰面積為1.489×106。endprint

由表3可知，去皮及帶皮小鱷龜肉中分別檢測(cè)出33 種和37 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，相同成分共有8 類(lèi)、23 種，分別是烴類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、醚類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)化合物。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量與風(fēng)味特征沒(méi)有直接關(guān)系，小鱷龜肉的整體風(fēng)味由揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的感覺(jué)閾值和相對(duì)含量共同決定。壬醛在去皮及帶皮小鱷龜肉中的相對(duì)含量均較高，且感覺(jué)閾值相對(duì)較小（1.0 μg/kg），對(duì)小鱷龜肉的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，因此定義壬醛的ROAVstan=100.00，其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV由1.3.5節(jié)中的公式計(jì)算得到。所有可測(cè)得ROAV的物質(zhì)均滿(mǎn)足0≤ROAV≤100.00，ROAV越大的組分對(duì)樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)率也越大，其中ROAV≥1.00的組分為樣品的重要風(fēng)味成分，0.10≤ROAV≤1.00的組分為樣品中比較重要的風(fēng)味成分。小鱷龜肉的主體風(fēng)味物質(zhì)由D-檸檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等構(gòu)成，因此小鱷龜肉的主體風(fēng)味物質(zhì)主要是醛類(lèi)物質(zhì)；2-甲基萘、苯乙酮、乙酸丁酯及2-乙酰基噻唑等化合物對(duì)小鱷龜肉的整體風(fēng)味有比較重要的影響。

肉中的烴類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)自脂肪酸烷氧自由基的均裂，烴類(lèi)物質(zhì)同時(shí)也是某些雜環(huán)化合物的重要前體物質(zhì)，對(duì)整體風(fēng)味有重要作用[16]；大部分醛類(lèi)物質(zhì)來(lái)自肉中脂肪酸的氧化分解，是對(duì)肉制品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的一類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味成分[17-20]，飽和直鏈醛（如壬醛、庚醛和己醛等）在小鱷龜肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中占較大比例，對(duì)小鱷龜肉腥味的產(chǎn)生起著重要作用，己醛是由肉中的亞油酸氧化形成的，目前己醛已經(jīng)是評(píng)價(jià)肉制品氧化程度與風(fēng)味的可靠指標(biāo)；醇類(lèi)物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的影響不如醛類(lèi)物質(zhì)顯著，但也對(duì)整體風(fēng)味有關(guān)鍵貢獻(xiàn)[21]；酯類(lèi)物質(zhì)通常是由肌肉中的脂肪氧化所產(chǎn)生的游離脂肪酸與醇類(lèi)物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的；而酮類(lèi)物質(zhì)則由不飽和脂肪酸的熱降解或氧化降解產(chǎn)生，感覺(jué)閾值較高，對(duì)肉品風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[22]。

具有魚(yú)腥味的庚醛和己醛在帶皮小鱷龜肉中的含量高于去皮小鱷龜肉，帶皮小鱷龜肉的異味大于去皮小鱷龜肉，因此小鱷龜皮可能是小鱷龜肉腥味的主要來(lái)源之一。這一結(jié)論能夠?yàn)闇p少小鱷龜肉產(chǎn)品中的異味（腥味）提供依據(jù)和參考，使此類(lèi)產(chǎn)品能被更多的消費(fèi)者所接受。

3 結(jié) 論

本研究采用SPME-GC-MS法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出提取小鱷龜肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最佳條件為萃取時(shí)間25 min、萃取溫度60 ℃、樣品添加量1.0 g。在此萃取條件下，利用各揮發(fā)性化合物的ROAV推斷小鱷龜肉的關(guān)鍵風(fēng)味成分，結(jié)果表明，小鱷龜肉的主體風(fēng)味物質(zhì)由D-檸檬烯、壬醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、（Z）-4-庚烯醛、苯乙醛、庚醛、己醛、

1-辛烯-3-醇、二甲基硫醚及2-乙基呋喃等化合物構(gòu)成，并推測(cè)小鱷龜皮可能是小鱷龜肉腥味的主要來(lái)源之一，為小鱷龜肉制品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與研究提供參考。

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