探討卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達及其在漿液性癌細胞增殖中的作用

侯祥位+陳立俠

【摘要】 目的：探討Rap1蛋白卵巢漿液性癌組織中的表達及其在漿液性癌細胞增殖中的作用。方法：對筆者所在醫(yī)院2015年4月-2017年4月手術(shù)切除的卵巢標本資料實施統(tǒng)計分析，其中20份為漿液性卵巢癌組織標本，良性腫瘤組織標本10份。另對同期手術(shù)切除的正常卵巢組織標本10份的臨床資料進行統(tǒng)計分析，進行細胞培養(yǎng)、Western blot檢測，設(shè)計siRNA靶序列，構(gòu)建靶向Rap1 的siRNA 真核表達載體，建立SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，進行MTT實驗，然后對卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達、SKOV3細胞增殖受Rap1基因下調(diào)的影響進行分析。結(jié)果：卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達線顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Rap1組細胞的增殖速度顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont組細胞的增殖速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達較高，其會對漿液性癌細胞增殖進行抑制。

【關(guān)鍵詞】 卵巢漿液性癌組織； Rap1蛋白表達； 漿液性癌細胞增殖； 作用

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.25.028 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）25-0055-02

為了將漿液性癌細胞增殖中Rap1蛋白表達的作用闡明，本研究對卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達進行了比較，同時將Rap1 shRNA真核表達載體構(gòu)建了起來，在此過程中將RNA干擾技術(shù)充分利用了起來，并建立了SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株篩選，對SKOV3 細胞增殖能力（Rap1表達缺失）的變化進行檢測，在此過程中運用MTT法，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

對筆者所在醫(yī)院2015年4月-2017年4月手術(shù)切除的卵巢標本的臨床資料進行統(tǒng)計分析，納入標準：所有患者均具有完整的臨床病歷資料。排除標準：將合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、術(shù)前接受放化療治療等卵巢癌患者排除在外。其中20份為液性卵巢癌組織標本，良性腫瘤組織標本10份。另對同期手術(shù)切除的正常卵巢組織標本10份的臨床資料進行統(tǒng)計分析，所有標本均以子宮肌瘤為原發(fā)病。切除離體后的標本第一時間放置在液氮中保存?zhèn)溆?。病理科醫(yī)師閱片對所有標本的病理診斷進行證實。采用筆者所在醫(yī)院實驗研究中心提供的感受態(tài)宿主菌大腸桿菌DH-5α，購買美國Oligo-engine公司生產(chǎn)的pSUPER.retro.neo/GFP（Empty）真核表達載體，GFP、Neo、Amp分別為綠色熒光標記、真核篩選基因（G418）、氨芐抗性基因。EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ為酶切位點，含H1啟動子。購買重慶醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室提供的卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3。本課題組在前期工作中已經(jīng)將陰性質(zhì)粒（NT）、空載體（Empty）建立了起來。購買寶生物工程（大連） 有限公司生產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、兔抗Rap1單克隆抗體，美國Invitrogen公司生產(chǎn)的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，美國Progema公司生產(chǎn)的T4DNA連接酶，HyClone公司生產(chǎn)的胎牛血清、RPM1640培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 常規(guī)培養(yǎng)SKOV3-Rap1-RNAi 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株（Rap1i-1）、SKOV3細胞野生型（WT）、陰性質(zhì)粒（NT.cont）、空載體（Empty）轉(zhuǎn)染細胞株，位置為RPM1640培養(yǎng)基，實驗細胞呈對數(shù)生長[1]。

1.2.2 Western blot檢測 將總蛋白提取出來，途徑為對各組組織及細胞進行裂解，然后對蛋白濃度進行測定，然后進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）前將60μg總蛋白從每個上樣孔取出來，轉(zhuǎn)膜，ECI顯色前孵育，孵育過程中將抗體充分利用起來。成像過程中將凝膠成像儀充分利用起來，然后將各組蛋白條帶的灰度值計算出來，計算過程中將Quantity One圖像分析軟件充分利用起來。蛋白相對表達量=蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參灰度值[2]。

1.2.3 設(shè)計siRNA靶序列 對人Rap1基因全序列（NM_001010935.1）全長序列進行檢索，檢索過程中將GenBank充分利用起來，將3對Rap1 siRNA序列設(shè)計出來，Rap1 shRNA1基因序列為5-GATCCCCTGCCAACAGTGTATGCTCGTTCAAGAGACGAGCATACACTGTTGGCATTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA2基因序列為5-GATCCCCGATGAGCGAGTAGTTGGCATTCAAGAGATGCC-AACTACTCGCTCATCTTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA3基因序列為5GATCCCCAGTGGTGTAACTGTGCCTTTTCAAGAGAAAGGCACAGTTACACCACTTTTTTGGAAA-3。其含19 nt，設(shè)計過程中將Oligoengine RNAi設(shè)計軟件充分利用起來，并對siRNA設(shè)計原則進行嚴格遵循，合成主體為invitrogen[3]。

1.2.4 構(gòu)建靶向Rap1 的siRNA 真核表達載體 將正義鏈、反義鏈退火，其由化學(xué)合成，將良好的前提條件提供給shRNA表達模板的形成，連接pSUPER.retro.neo/GFP 質(zhì)粒，其經(jīng)BglⅡ、HindⅢ雙酶切后線性化，然后向感受態(tài)宿主菌大腸桿菌DH-5α轉(zhuǎn)化，將質(zhì)粒提取出來，雙酶切重組質(zhì)粒，在此過程中將限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ充分利用起來，37 ℃水浴4 h，之后電泳分析，在此過程中將1%瓊脂糖凝膠充分利用起來。向invitrogen送往進行DNA測序鑒定前保證質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定成功[4]。endprint

1.2.5 建立SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 將對數(shù)生長期的SKOV3細胞取出來，細胞滿意度達70%～80%后轉(zhuǎn)染，同時將多個單克隆細胞篩選制備出來，在此過程中將G418充分利用起來，進一步擴大培養(yǎng)，將Rap1具有最顯著沉默效果的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株篩選出來前將總蛋白提取出來，在此過程中將免疫印跡篩選出來[5]。

1.2.6 MTT試驗 將200 μl細胞懸液取出來，有2000個細胞存在于每孔，向96孔板中對細胞進行接種，每組5個復(fù)孔，同時將空白孔設(shè)立出來調(diào)零，共將7個培養(yǎng)板接種出來，在孵箱中放置進行常規(guī)培養(yǎng)。接種細胞，一周內(nèi)每天取1個96孔板，加入20μl的5mg/ml 噻唑藍（MTT）溶液，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置進行4 h的孵育，將培養(yǎng)終止，將孔內(nèi)細胞培養(yǎng)上清液小心吸棄，在此過程中將1 ml注射器充分利用起來。將150 μl二甲亞砜（DMSO）再加入到每孔中，進行10 min的振蕩，對結(jié)晶物進行充分溶解。將570 nm波長選取出來，對各孔光密度值進行測定，位置為酶標儀，并將結(jié)果詳細記錄下來，將縱坐標設(shè)定為光密度值，將橫坐標設(shè)定為時間，將細胞生長曲線繪制出來[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達比較

卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達為（1.190±0.062）%，顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織的（0.613±0.080）%、（0.402±0.052）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具體見圖1。

2.2 SKOV3細胞增殖受Rap1基因下調(diào)的影響

Rap1組細胞的增殖速度為（1.5±0.2），顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細胞的0、（1.0±0.2）、（0.9±0.1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont組細胞的增殖速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

3 討論

在婦科惡性腫瘤病死率中，卵巢癌位居首位，對婦女的健康及生命造成了嚴重威脅[7]。在腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移中，腫瘤細胞內(nèi)的各種信號通路發(fā)揮著不同的作用，Rap1屬于類Ras家族成員，是一種分子開關(guān)，在細胞增殖、形態(tài)發(fā)生等多種信號通路中參與對其進行調(diào)節(jié)[8]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明，Rapl活性一旦失調(diào)，惡性腫瘤就會發(fā)生發(fā)展，同時Rapl有細胞特異性功能，比如，對NIH3T3細胞及星形膠質(zhì)細胞（Ras轉(zhuǎn)染）增殖進行抑制，但是卻為Swiss3T3細胞DNA合成提供良好的前提條件，促進細胞增殖速度的加快[9-11]。本研究結(jié)果表明，卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達線顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Rap1組細胞的增殖速度顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明Rap1蛋白卵巢漿液性癌組織中的表達較高，其會抑制漿液性癌細胞增殖，值得臨床充分重視。

參考文獻

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（收稿日期：2017-05-15）endprint