高效液相色譜法測定魚肉中氟喹諾酮類藥物的研究

薄懷艷+陳燕+葛翠蓮+張延龍

摘 要：采用高效液相色譜—熒光法（HPLC-FLD）檢測魚肉中兩種氟喹諾酮類藥物。魚肉樣品經磷酸鹽緩沖溶液勻漿后轉入離心管，離心并提取上清液，上清液過固相萃取柱用水淋洗，濟干，用流動性（乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺調pH2.4）體積比20：80）定容。通過對魚肉樣品中氟喹諾酮類藥物的檢測表明該方法具有準確、快速、靈敏的特點。

關鍵詞：高效液相色譜法；氟喹諾酮類藥物；殘留分析；魚肉

氟喹諾酮類藥物是喹諾酮類藥物的第三代產品，它代指一族人工合成的具有6-氟-4-喹諾酮環(huán)基結構的廣譜殺菌性抗菌劑，對革蘭氏陽性菌和陰性菌、支原體、某些厭氧菌均有效，主要通過抑制細菌DNA螺旋酶作用，阻礙DNA合成而導致細菌死亡。因具抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強等特點，目前氟喹諾酮類藥物在醫(yī)學和獸醫(yī)學中應用廣泛，但其殘留可導致人體病原體的耐藥性，而且有關氟喹諾酮類藥物還有潛在的致癌性和遺傳毒性，同時還容易使病菌產生耐藥性，所以歐盟和北美等國家只批準恩諾沙星為動物專用的抗菌藥了，環(huán)丙沙星已禁止在水產養(yǎng)殖業(yè)中使用。動物源性食品的安全性，對其殘留量的檢測越來越受到關注。目前，常用于氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法可分為4大類：微生物法、儀器分析法、化學發(fā)光與電化學發(fā)光分析法及免疫分析法。其中儀器分析法常見的有高效液相色譜法、液-質聯(lián)用分析法等；本文是用高效液相色譜-熒光法檢測方法，用磷酸鹽緩沖溶液作為提取液，可同時檢測魚肉中環(huán)丙沙星、恩諾沙星兩種氟喹諾酮類藥物，該方法操作方便快捷、節(jié)約成本，能夠滿足我國現行獸藥殘留檢測分析的要求。

一、材料與方法

1.儀器與設備

高效液相色譜儀（配熒光檢測器），高速勻漿均質器，離心機，天平，渦旋機，固相萃取柱，微孔濾膜。

2.材料與試劑

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、濃磷酸、磷酸二氫鉀、三乙胺、氫氧化鈉、甲醇，實驗室用水為高純水。

3.方法

（1）溶液配制。5.0mol/L氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉飽和溶液28ml，加水稀釋至100ml。0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4ml，用水稀釋至1000ml，用三乙胺調PH至2.4。

磷酸鹽緩沖溶液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水使溶解并稀釋至500ml，用5mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)PH至7.0。

（2）魚肉樣品處理。

①提?。喝〖s500g魚肉，用攪碎機攪碎混勻，稱取2（+0.05）g魚肉，置50ml離心管中，加磷酸鹽緩沖溶液10.0ml，10000r/min勻漿1min，勻漿液放入離心機中10000r/min、5min，取上清液，待用。用磷酸鹽緩沖溶液10.0ml洗刀頭及殘渣，充分渦旋混勻，在放入離心機中10000r/min、5min，合并兩次上清液，混勻，備用。

②凈化：固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸鹽緩沖溶液各2ml預洗。取上清液5.0ml過柱，用水1.0ml淋洗，濟干。用流動相1.0ml洗脫，濟干，收集洗脫液。經濾膜過濾后作為進樣溶液，供高效液相色譜法測定。

（3）色譜條件。

色譜柱：C18柱（5um，4.6×250mm）。

流動相：0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺調pH2.4）體積比20：80，使用前經微孔濾膜過濾。

檢測波長：254nm。

柱溫：室溫。

進樣量：20ul。

（4）流動相的選擇。

經②小節(jié)中經濾膜過濾后作為進樣溶液，過濾至高效液相進樣瓶中，進行高效液相測定分析。根據分離效果選擇流動相。

（4）線性分析。分別配制0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mol/l環(huán)丙沙星和恩諾沙星標準混合溶液，依次進樣20ul進行分析。

二、結果與分析

流動相的選擇。經過實驗比較流動相乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺調pH2.4）與乙腈、0.01mol/L磷酸二氫鈉（磷酸調PH2.4）的靈敏性，流動相乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺調pH2.4）對目標峰的響應最靈敏，加入三乙胺的目的是為了防止目標峰拖尾，所以最終確定流動相為乙腈、0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（三乙胺調pH2.4）。恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準品譜圖見圖1，環(huán)丙沙星和恩諾沙星標準溶液線性范圍內峰高見表1。

三、結語

本方法測定魚肉中的環(huán)丙沙星、恩諾沙星的殘留，檢測條件穩(wěn)定，可操作性強，應用簡單方便。對農產品質量安全檢測中心開展動物組織中獸藥殘留檢測工作具有現實指導意義。

參考文獻：

[1]蔣小武.淺析氟喹諾酮類獸藥殘留檢測方法[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2011 ， 27 （3） ：188-190.

[2]朱莉萍， 朱濤， 武娜，等. 高效液相色譜法測定豬肉中氟喹諾酮類藥物[J]. 肉類研究，2011（10）：29-31.endprint