15種重樓屬植物中8種甾體皂苷的含量測定

黃圓圓 劉大會 彭華勝 郝慶秀 陳美蘭 張啊中 陳敏 康利平 黃璐琦

[摘要]建立了同時測定重樓中 8種重樓皂苷（重樓皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ， 薯蕷皂苷和纖細(xì)薯蕷皂苷）的分析方法，并對15種重樓屬植物根莖中重樓皂苷的含量進(jìn)行了評價。本研究采用Waters Acquity HClass TM液相色譜系統(tǒng)，PDA檢測器，色譜柱為資生堂CAPCELL PAK ADME 色譜柱（46 mm×250 mm， 5 μm），乙腈水為流動相（08 mL·min-1）梯度洗脫，柱溫21 ℃；檢測波長為203 nm?？芍?種重樓皂苷得到良好分離，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，且線性良好（R2>0999 9），線性范圍較寬（0041 70～3812 00 μg），平均回收率在9591%～1038%。②不同種重樓中重樓皂苷的含量差異顯著，毛重樓、狹葉重樓和金線重樓中含量較低或基本不含重樓皂苷，不適合作為重樓藥用；不同產(chǎn)地的七葉一枝花含量差異顯著；滇重樓、長柱重樓、大理重樓和五指蓮中重樓皂苷含量較高，最高達(dá)50%，長柱重樓、大理重樓和五指蓮可作為潛在的重樓藥用資源。

[關(guān)鍵詞]重樓屬； 甾體皂苷； 含量測定； 高效液相色譜法

Determination of eight steroidal saponins in 15 kinds of genus Paris

HUANG Yuanyuan1，2， LIU Dahui3， PENG Huasheng1， HAO Qingxiu2， CHEN Meilan2，

ZHANG Azhong4， CHEN Min2， KANG Liping2*， HUANG Luqi2*

（1School of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230012， China；

2State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3College of Pharmacy， Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430065， China；

4Lanping County in Ecological Industry Co， Ltd， Nujiang 673100， China）

[Abstract]The study was established an HPLC method for simultaneous determination of 8 steroidal saponins （polyphyllins Ⅶ， H， Ⅵ， Ⅱ， Ⅰ， and Ⅴ， dioscin， and gracillin） in Paridis Rhizoma， and made an evaluation by determining steroidal saponins in 15 kinds of genus Paris The analysis was performed on a Waters Acquity HClassTM UPLC ultrafine liquid chromatography system coupled with a PDA detector The chromatographic separation was achieved through a CAPCELL PAK ADME （46 mm× 250 mm， 5 μm） column and the optimal mobile phase consisted of acetonitrile and water The column was maintained at 21 ℃， and the flow rate was 08 mL·min-1 The UV detection wavelength was 203 nm The results showed that ① the detected components can be well separated and all with good correlation coefficients The standard calibration curves were linearly good （R2>0999 9） The linearity was obtained over 0041 703812 00 μg The average recoveries ranged from 9591% to 1038% ② there are significant differences in the content of steroidal saponins from different species The steroidal saponins are low content or almost none in P. mairei， P. polyphylla var stenophylla， and P. delavayi have low content or almost did not contain， so these species are not suitable for medicinal use The contents of steroidal saponins in P. polyphylla var chinensis are varied from different places There were high content of steroidal saponins in P. polyphylla var yunnanensis， P. forrestii， P. daliensis， and P. axialis， even up to 50%， which indicated that they had the potential pharmic value of developmentendprint

[Key words]Paris L； steroidal saponins； content determination； HPLC

重樓用藥歷史悠久，最早以“蚤休”之名收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其后歷代本草古籍均有記載。2015版《中國藥典》收錄重樓為百合科重樓屬云南重樓Paris polyphylla Smith var yunnanensis （Franch） Hand-Mazz或七葉一枝花P. polyphylla Smith var chinensis（Franch） Hara的根莖。重樓性寒、味苦，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，用于咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風(fēng)抽搐等證[1]。現(xiàn)代研究表明其主要化學(xué)成分為甾體皂苷類化合物，具有止血、抗腫瘤、抗病毒、抗菌等藥理活性[24]。重樓大量應(yīng)用在40余種中成藥中，如云南白藥、宮血寧、金復(fù)康口服液、樓連膠囊和季勝德蛇藥片等[5]。隨著重樓需求量的不斷增長及巨額利潤的驅(qū)動，長期掠奪式的采挖直接導(dǎo)致重樓的野生資源更加稀缺。重樓繁殖率低，再生較慢，各產(chǎn)區(qū)藥材蘊(yùn)藏量普遍下降，部分品種已瀕臨滅絕[6]；雖然目前有人工種植，但重樓種植周期長，投資風(fēng)險(xiǎn)較高，資源匱乏已是不爭事實(shí)[7]。

我國約有19種重樓屬植物（不含變種）[8]，在實(shí)際使用中，除滇重樓和七葉一枝花外，其他重樓屬品種在民間也常作為重樓使用。王躍虎等[9]通過整理文獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)出18個藥用種和變種。不同種重樓在化學(xué)成分上雖有其相似之處，但也存在著很大的差異[1012]，它們是否都能夠作為重樓入藥是個值得探討的問題。2015年版《中國藥典》僅僅是將重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的總含量作為重樓質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)，而重樓皂苷H、重樓皂苷V、薯蕷皂苷和纖細(xì)薯蕷皂苷也均為重樓中主要活性成分， 具有顯著的止血和細(xì)胞毒等活性[4，9]，所以藥典方法并不能全面反映重樓的質(zhì)量優(yōu)劣。雖然有學(xué)者對重樓中活性成分進(jìn)行了定量分析[1315]，但多是針對藥典收載的2個品種，目前尚未見有關(guān)重樓屬多種植物皂苷成分系統(tǒng)的定量分析報(bào)道。為了更加全面評價重樓藥材的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC 同時測定8種重樓甾體皂苷含量的方法，并對收集到的15種重樓的皂苷含量進(jìn)行了測定和分析。

1材料

Waters Acquity HClass UPLCTM液相色譜儀串聯(lián)外接柱溫箱（包括四元溶劑管理器、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、PDA檢測器、Empower 3工作站，美國Waters 公司），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），METTLER TOLEDO XS105DU分析天平（梅特勒托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司），超聲波清洗器（SB800 DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司），資生堂CAPCELL PAK ADME 色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）。

乙醇（分析純，批號20160918）購自北京化工廠，甲醇（色譜純，UN 1230）和乙腈（色譜純，UN 1648）購自德國默克股份有限公司，超純水自制（Thermo Barnstead GenPure UV/UF）。

對照品重樓皂苷Ⅶ（純度925%，批號111593201303）、重樓皂苷Ⅵ（純度951%，批號111592201203）、重樓皂苷Ⅱ（純度934%，批號111591201103）和重樓皂苷Ⅰ（純度936%，批號111590201604）購自于中國食品藥品檢定研究院，重樓皂苷H（純度≥98%，批號H036161001）、重樓皂苷Ⅴ（純度≥98%，批號H036150215）、薯蕷皂苷（純度≥98%，批號S048160408）、纖細(xì)薯蕷皂苷（純度≥98%，批號X053151111）購于北京融誠鑫德科技發(fā)展有限公司。

15種重樓實(shí)驗(yàn)樣品主要采于云南，部分來自河南、福建和湖北，均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為七葉一枝花P. polyphylla var chinensis、滇重樓P. polyphylla Smith var yunnanensis（Franch） Hand -Mazz、南重樓P. vietnamensis （Takht） H Li、長柱重樓P. forrestii （Takht） H Li、金線重樓P. delavayi Franch、長藥隔重樓P. polyphylla varpseudothibetica H Li、黑籽重樓P. thibetica Franch、大理重樓P. daliensis H Li et V G Soukup、毛重樓P. mairei Lévl、五指蓮P. axialis H Li、多葉重樓P. polyphylla Smith、狹葉重樓P. polyphylla var stenophylla Franch、卵葉重樓P. delavayi var petiolata（Baker ex C H Wright） H Li、球藥隔重樓P. fargesii Franch、短瓣球藥隔重樓P. fargesii var brevipetalata （Huang et Yang） H Li 共計(jì)15種，樣品詳細(xì)信息見表1。所有植物標(biāo)本存于安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

2方法和結(jié)果

21色譜條件

色譜柱CAPCELL PAK ADME 色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）水（B）； 梯度洗脫0～9 min，35%～44% A， 9～22 min，44% A，22～38 min，44%～47% A， 38～39 min，47%～98% A；流速08 mL·min-1；檢測波長203 nm；柱溫21 ℃；進(jìn)樣量10 μL。重樓皂苷對照品和重樓樣品的色譜圖，見圖1。

22供試品溶液的制備

取重樓藥材粉末約05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，高速離心15 min，取上清液過022 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。endprint

23對照品溶液的制備

分別精密稱取適量重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ對照品，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0334，0348，0267，0327，0362，0381，0361，0340 g·L-1的混合對照品母液，并逐級稀釋。

24含量測定的方法學(xué)考察

241線性關(guān)系取混合對照品溶液母液，將母液逐級稀釋，每個濃度混合對照品進(jìn)樣10 μL，在上述21項(xiàng)條件，以峰面積為縱坐標(biāo)，以各重樓皂苷對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)確定標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比S/N=10為基準(zhǔn)，測得最低定量限，以信噪比S/N=3為基準(zhǔn)，測得最低檢測限。重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ 的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、最低定量限和最低檢測限，見表2。結(jié)果表明8種重樓皂苷有良好的線性范圍和線性關(guān)系。

242精密度試驗(yàn)取混合對照品溶液，按照21項(xiàng)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ 色譜峰峰面積的RSD（n=6）分別為070%，080%，080%，10%，090%，070%，080%，090%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

243重復(fù)性試驗(yàn)取重樓藥材（批號431382120521010YC）粉末約05 g，平行6份，精密稱定，用22項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照21項(xiàng)條件分析，計(jì)算樣品中重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ含量的RSD 分別為12%，095%，19%，22%，070%，054%，064%，14%，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

244穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液（批號431382120521010YC）分別于0，2，4，8，16，24，48，72 h進(jìn)樣測定，供試品溶液中重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ的色譜峰峰面積的RSD （n=8） 分別為010%，050%，13%，090%，12%，060%，050%，060%，結(jié)果表明供試品溶液在3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

245加樣回收率試驗(yàn)取已知含量重樓藥材粉末（批號431382120521010YC）約025 g×9，精密稱定，按照相當(dāng)于藥材中重樓皂苷80%，100%，120% 的比例，分別精密加入混合對照品溶液25 mL， 同上供試品的制備方法，在上述的色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ的回收率，回收率=（C-A）/B×100%，A為所用重樓藥材中含被測成分的量，B為加入對照品量，C為混樣的實(shí)測值，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

25樣品的含量測定

取不同來源和不同品種的重樓藥材，按照23項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照21項(xiàng)方法測定重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ 的含量見圖2，表4。

3討論

重樓皂苷的極性較大，結(jié)構(gòu)相似，不易良好分離[16]。本實(shí)驗(yàn)考察了不同型號的色譜柱Waters HSS T3，Agilent ZORBAX SB C18，Thermo Syncronisa Q對重樓樣品的分離效果，最終確定使用資生堂的CAPCELL PAK ADME 色譜柱。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，柱溫低較時，8種重樓皂苷的分離效果好，最終確定色譜柱柱溫為21 ℃。

對各樣品中的8種主要活性成分進(jìn)行了定量分析。原來考慮將重樓皂苷D[17]和Tc[18]一塊測定，但發(fā)現(xiàn)所有樣品中除南重樓中含有大量重樓皂苷D外，其他樣品中的重樓皂苷D和Tc的含量多低于定量下限，且分離效果不太理想，所以本次實(shí)驗(yàn)沒有將兩者統(tǒng)一測定。此次所測樣品中有不少不符合2015年版《中國藥典》規(guī)定的重樓皂苷Ⅶ， Ⅵ， Ⅱ， Ⅰ的總量大于06% 的要求。其中毛重樓、金線重樓和狹葉重樓中皂苷含量很低或幾乎沒有，應(yīng)該不能作為重樓入藥。多數(shù)多葉重樓的皂苷含量也很低，但其中59和60樣品的含量較高，可能受產(chǎn)地影響較大。南重樓中雖然藥典規(guī)定4種皂苷含量較低，但8種總皂苷含量較高，有的不低于滇重樓。大理重樓、卵葉重樓、球藥隔重樓、長柱重樓和五指蓮，這幾種重樓的皂苷含量基本符合藥典要求，可以考慮作為替代資源進(jìn)行研究開發(fā)。其中大理重樓，卵葉重樓和球藥隔重樓以偏諾皂苷為主，而長柱重樓和五指蓮主要以薯蕷皂苷為主。偏諾糖苷較薯蕷糖苷具有較好止血作用，薯蕷糖苷通常較偏諾糖苷具有很好的細(xì)胞毒活性[3，17]，從這方面考慮，不同品種的重樓在藥理作用上可能存在差異，在臨床上使用時應(yīng)加以考慮。另外，本次實(shí)驗(yàn)的多數(shù)樣品采集于云南，對其他產(chǎn)地的樣品的代表性值得進(jìn)一步商榷。

在測定結(jié)果中，同種重樓之間的含量差異也較大。滇重樓根據(jù)植株形態(tài)的差異，分為傳統(tǒng)型、多葉型和大理型等多種，其中傳統(tǒng)型的滇重樓薯蕷皂苷的含量較偏諾皂苷高，而大理型的主要以偏諾皂苷為主，這一現(xiàn)象值得深入研究。滇重樓地下根莖的皂苷含量在10月份達(dá)到最大值，但本研究所測的重樓樣品大多采于5—8月份，因此部分樣品甾體皂苷的量低于2015年版藥典規(guī)定量（>06%），這可能與采收的季節(jié)以及重樓的生長年限有關(guān)[19]。在重樓藥材中，各皂苷的含量差異較大，藥典中同時測定重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的含量，雖然同時考慮了薯蕷類糖苷和偏諾類糖苷的含量，并不能很好的反應(yīng)藥材的品質(zhì)，應(yīng)將其中含量較高的纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷H及薯蕷皂苷的含量考慮其中。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLCUV含量測定方法，具有良好的精密度和重復(fù)性，能簡單有效同時評價重樓屬植物中多種皂苷類成分，便于定量評價及質(zhì)量控制。

[致謝]重樓屬植物采樣和鑒定過程中得到了云南彝道農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、文山圣龍農(nóng)業(yè)合作社、云南煜欣農(nóng)林生物科技有限責(zé)任公司和中國科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員的幫助和支持。endprint

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint