針對(duì)癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的長(zhǎng)肽疫苗設(shè)計(jì)及其免疫活性檢測(cè)*

翟文杰，吳亞紅，韓艷林，李國(guó)棟，陳真真，杜江峰，祁元明，高艷鋒

鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

針對(duì)癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的長(zhǎng)肽疫苗設(shè)計(jì)及其免疫活性檢測(cè)*

翟文杰，吳亞紅，韓艷林，李國(guó)棟，陳真真，杜江峰，祁元明，高艷鋒#

鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

腫瘤免疫；癌睪抗原；表位預(yù)測(cè)；長(zhǎng)肽

目的：設(shè)計(jì)針對(duì)癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的長(zhǎng)肽，并檢測(cè)其免疫活性。方法利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PLAC1、PL2L60、MAGE-3的CTL表位，在表位集中區(qū)域選取適當(dāng)長(zhǎng)度的長(zhǎng)肽，化學(xué)合成并純化后，通過(guò)體外和體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證長(zhǎng)肽是否具有免疫活性。結(jié)果針對(duì)PLAC1、PL2L60、MAGE-3預(yù)測(cè)出HLA-A2限制性CTL表位并設(shè)計(jì)出7條長(zhǎng)肽。體外自提呈、DC荷肽的ELISPOT結(jié)果和體外LDH結(jié)果顯示，PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175等4條長(zhǎng)肽具有較好的免疫活性；體內(nèi)ELISA結(jié)果顯示MAGE-3 P152-175在HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)了較多的IFN-γ釋放，體內(nèi)LDH結(jié)果顯示PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175等4條長(zhǎng)肽所誘導(dǎo)的HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞具有較高的殺傷率。結(jié)論成功篩選鑒定出針對(duì)癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3的4條長(zhǎng)肽，可用作免疫治療疫苗。

腫瘤，特別是惡性腫瘤是影響人類健康和生存質(zhì)量的重大疾病之一，治療腫瘤的方法有手術(shù)摘除、放療、化療及聯(lián)合治療等，雖然有一定的治愈率，但存在著術(shù)后復(fù)發(fā)率高或毒副作用強(qiáng)的問(wèn)題。腫瘤免疫治療是通過(guò)激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能來(lái)控制和殺死腫瘤細(xì)胞[1]，具有特異性強(qiáng)和不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。癌睪抗原作為腫瘤抗原可以引起細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫應(yīng)答而不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成影響[4]，因此具有較高的研究?jī)r(jià)值，其中胎盤特異性基因1(placenta-specific 1，PLAC1)、生殖干細(xì)胞基因PIWIL2異化激活的產(chǎn)物之一PL2L60蛋白、黑色素瘤相關(guān)抗原3[5](melanoma-associated antigen 3，MAGE-3)是3種較為常見(jiàn)的癌睪抗原。多肽疫苗通常是指人工化學(xué)合成的腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原中的某一肽段。腫瘤多肽疫苗具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、制作方便、無(wú)需細(xì)菌病毒等載體、腫瘤型別通用性強(qiáng)、有效率高、治療費(fèi)用相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì)。使用軟件預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域，篩選包含這個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)肽，這個(gè)長(zhǎng)肽可能會(huì)在體內(nèi)被抗原提呈細(xì)胞加工成多個(gè)CTL表位或者一些未知的MHC Ⅱ限制性CD4的輔助表位，同時(shí)也能克服短肽在體內(nèi)降解較快的缺點(diǎn)，因而可能具有良好的抗腫瘤效果。作者選取3個(gè)癌睪抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3進(jìn)行預(yù)測(cè)，并設(shè)計(jì)長(zhǎng)20～25個(gè)氨基酸的長(zhǎng)肽進(jìn)行免疫活性實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證所設(shè)計(jì)長(zhǎng)肽的免疫效果，為多肽疫苗的應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1血液樣本、細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抽取3名HLA-A2志愿者的外周血，用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。T2A2細(xì)胞：轉(zhuǎn)染HLA-A*0201分子的TAP缺陷T2細(xì)胞系，由第三軍醫(yī)大學(xué)吳玉章教授惠贈(zèng)，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靶細(xì)胞MCF-7：乳腺癌細(xì)胞系，經(jīng)鑒定證實(shí)過(guò)表達(dá)PLAC1、PL2L60和MAGE-3，由實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)及保存。小鼠：SPF級(jí)HLA-A2.1/Kb 轉(zhuǎn)基因小鼠，由第二軍醫(yī)大學(xué)曹雪濤教授惠贈(zèng)，在IVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中飼養(yǎng)，選取8～12周齡的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑和實(shí)驗(yàn)器材IMDM干粉培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)，RPMI 1640基質(zhì)培養(yǎng)基(北京索萊寶生物科技有限公司)，胎牛血清(無(wú)噬菌體，杭州四季青公司)，CpG ODN-1826[生工生物工程(上海)股份有限公司]，DMSO、IFA、絲裂霉素C、LPS、人β2微球蛋白(Sigma公司)，紅細(xì)胞裂解液(北京曠博生物技術(shù)有限公司)，人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?，重組人IL-2、重組人IL-4、重組人IL-7、重組鼠IL-2、LDH細(xì)胞毒試劑盒(以色列ProSpec-Tany TechnoGene有限公司)，人IFN-γ ELISPOT檢測(cè)試劑盒、鼠IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO2孵育箱(日本三洋工業(yè)株式會(huì)社)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電科技儀器有限公司)。

1.3 3種抗原的氨基酸序列及設(shè)計(jì)長(zhǎng)肽的合成3種抗原的氨基酸序列全長(zhǎng)由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，人源PLAC1氨基酸序列(212個(gè)氨基酸)，AAG22596.1；人源PL2L60序列(530個(gè)氨基酸)，ADV17663.1；人源MAGE-3氨基酸序列(314個(gè)氨基酸)，AAA17446.1。運(yùn)用3個(gè)在線預(yù)測(cè)軟件SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)、NetCTL1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/)對(duì)3個(gè)抗原進(jìn)行HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測(cè)。根據(jù)集中的HLA-A2限制性CTL表位設(shè)計(jì)3個(gè)抗原來(lái)源的長(zhǎng)肽，共獲得7條長(zhǎng)肽，分別為：PLAC1 P42-64、PL2L60 P41-64、PL2L60 P169-191、PL2L60 271-293、MAGE3 P101-122、MAGE-3 P152-175和MAGE-3 P271-293。依據(jù)3種抗原設(shè)計(jì)的長(zhǎng)肽由作者所在課題組采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc固相合成法合成，經(jīng)反相高效液相色譜法純化，純度>95%，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜法鑒定相對(duì)分子質(zhì)量符合理論值。

1.4DC的誘導(dǎo)及成熟分離外周血獲得PBMCs，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL-1，2 mL/孔接種于6孔板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；抽取液體及未貼壁細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)10% DMSO﹢體積分?jǐn)?shù)90%胎牛血清重懸，-80 ℃保存；每孔加入IMDM培養(yǎng)基2 mL，并加GM-CSF(100 μg/L)、IL-4(50 μg/L)，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d半量換液一次，并補(bǔ)加GM-CSF、IL-4；培養(yǎng)至第5天加入LPS(100 μg/L)，誘導(dǎo)DC成熟；48 h后收集細(xì)胞。

1.5體外肽特異性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)

1.5.1 自提呈實(shí)驗(yàn) 將PBMCs用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，每孔1 mL接種于24孔板，第2天加入1.3中制備的長(zhǎng)肽20 mg/L，第3天加入IL-2(50 U/mL)、IL-7(10 μg/L)繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d半量換液并補(bǔ)加IL-2。7 d后1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入新鮮的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，并補(bǔ)加IL-2、IL-7。共刺激3輪，之后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收集細(xì)胞進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 DC荷肽實(shí)驗(yàn) 收集成熟DC，無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基洗滌后重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為(0.5～1.0)×106mL-1，加入1.3中制備的長(zhǎng)肽20 mg/L，培養(yǎng)4 h；收集細(xì)胞，無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基洗滌1次后重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為(0.5～1.0)×106mL-1，加入50～100 μg的絲裂霉素C和20 mg/L長(zhǎng)肽，培養(yǎng)1 h，無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基洗滌1次，用含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105mL-1；復(fù)蘇之前凍存于-80 ℃冰箱的PBMCs，重懸、調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL-1，以荷肽的DC作為刺激細(xì)胞，各取0.5 mL加入24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)；隔日添加IL-2(50 U/mL)，每3 d半量換液，并補(bǔ)加IL-2；培養(yǎng)7 d后收集細(xì)胞，同法以101的比例與新鮮制備的荷肽DC共培養(yǎng)，進(jìn)行第2輪刺激；共刺激3次，第3次刺激后的第3天收集細(xì)胞，用于后續(xù)活性實(shí)驗(yàn)。

1.6小鼠體內(nèi)肽特異性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)將20只8～12周齡HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成5組，即PBS組、PLAC1 P42-64組、PL2L60 P169-191組、MAGE-3 P101-122組及MAGE-3 P152-175組，每組4只，每只小鼠每次注射100 μL以下試劑，PBS組給予30 μg CpG ODN-1826+50 μL PBS(pH 7.2)+50 μL IFA；其他4組分別以50 μL 2 g/L相應(yīng)長(zhǎng)肽代替PBS，其余同PBS組。分別在第0、6和13天在小鼠尾根部皮下進(jìn)行3次免疫注射，并記錄小鼠體重。第20天處死小鼠制備效應(yīng)細(xì)胞：無(wú)菌條件下摘取脾臟，200目篩網(wǎng)研磨獲取脾細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，900 r/min離心9 min，棄上清液后加入1 mL紅細(xì)胞裂解液(10×)，混勻，4 ℃裂解紅細(xì)胞10 min；900 r/min離心9 min，棄上清液，收集細(xì)胞，PBS(pH 7.2)洗滌2次；用10 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞，每孔5 mL接種于6孔板；第2天每孔加入250 U重組鼠源IL-2、CpG ODN-1826以及長(zhǎng)肽；于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，收集細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)的ELISA和細(xì)胞毒活性(LDH)檢測(cè)。

1.7ELISPOT實(shí)驗(yàn)按照作者所在的課題組常用的ELISPOT方法[6]，以1.5及1.6中誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL-1，每孔接種50 μL，每孔加10 μL長(zhǎng)肽(1 g/L)作為刺激物，采用IFN-γ ELISPOT檢測(cè)試劑盒檢測(cè)分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)。

1.8LDH實(shí)驗(yàn)按照作者所在的課題組常用的LDH法[6-7]進(jìn)行檢測(cè)。以1.5及1.6實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，MCF-7或荷載表位肽的T2A2細(xì)胞為靶細(xì)胞，效靶比分別為12.51、251和501，記錄殺傷率。

1.9ELISA法檢測(cè)體內(nèi)肽誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ量轉(zhuǎn)基因小鼠脫頸處死前摘眼球取血，室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心30 min，取上層血清，ELISA法檢測(cè)IFN-γ，按照說(shuō)明書操作。

1.10小鼠臟器指數(shù)取小鼠肝臟和腎臟，在電子天平上稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=器官質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)。

1.11數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較7組間自提呈實(shí)驗(yàn)和DC荷肽實(shí)驗(yàn)釋放IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)、5組小鼠T淋巴細(xì)胞IFN-γ的釋放量、小鼠體重及肝腎指數(shù)的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較自提呈實(shí)驗(yàn)和DC荷肽實(shí)驗(yàn)釋放IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1長(zhǎng)肽的設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2體外ELISPOT實(shí)驗(yàn)與PBS組相比，7條長(zhǎng)肽均能誘導(dǎo)3個(gè)志愿者的PBMCs產(chǎn)生活化的分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞，其中4條肽PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175有更多的IFN-γ斑點(diǎn)，因此后續(xù)選這4條肽進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。DC荷載長(zhǎng)肽刺激PBMCs后，與PBS組相比，7條長(zhǎng)肽同樣可以誘導(dǎo)更多的IFN-γ產(chǎn)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)肽在經(jīng)DC荷載后，誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞的能力得到增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 PLAC1、PL2L60和MAGE-A3抗原來(lái)源的長(zhǎng)肽設(shè)計(jì)結(jié)果

表2 ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自提呈實(shí)驗(yàn)與DC荷肽實(shí)驗(yàn)中釋放IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)(n=3)

#：與PBS組相比，P<0.05；*:與自提呈實(shí)驗(yàn)組相比，P<0.05。

2.3體外LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著效靶比的增大，特異性殺傷率也在增大，其中ELISPOT結(jié)果較好的3條肽PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、MAGE-3 P101-122的殺傷率均在28%左右。

2.4體內(nèi)LDH實(shí)驗(yàn)以MCF-7為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為免疫小鼠經(jīng)長(zhǎng)肽誘導(dǎo)后的脾細(xì)胞，設(shè)置效靶比分別為12.51、251、501，結(jié)果顯示4條長(zhǎng)肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞均有一定的殺傷率，其中，PL2L60 P169-191、MAGE-3 P152-175殺傷效果較好。見(jiàn)圖2上。以T2A2負(fù)載長(zhǎng)肽中對(duì)應(yīng)的短肽為靶細(xì)胞，以長(zhǎng)肽誘導(dǎo)后的脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行LDH實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)荷肽的T2A2有殺傷作用，但其殺傷效果不如對(duì)靶細(xì)胞MCF-7的殺傷效果。在效靶比為501時(shí)，幾條肽的殺傷率在10%～20%。見(jiàn)圖2下。

2.5體內(nèi)ELISA檢測(cè)IFN-γ的釋放量結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知，4條長(zhǎng)肽免疫小鼠后均可誘導(dǎo)一定量的IFN-γ產(chǎn)生。

圖1 自提呈實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)肽誘導(dǎo) 的特異性CTL的體外LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果

a、b:對(duì)應(yīng)的靶細(xì)胞分別為T2A2-P108-116、T2A2-P112-120。 圖2 長(zhǎng)肽誘導(dǎo)的特異性CTL的體內(nèi)LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果

F=20.997，P=0.003；*：與PBS組相比，P<0.05。

2.6小鼠生理指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。如表4所示，5組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肝腎指數(shù)均在正常范圍內(nèi)。

表4 長(zhǎng)肽疫苗對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠體重及肝腎指數(shù)的影響(n=4)

3 討論

多肽疫苗作為一種很有潛力的腫瘤疫苗已經(jīng)應(yīng)用于各種腫瘤的免疫治療中，并在原有誘導(dǎo)CTL的基礎(chǔ)上有了新的進(jìn)展，多表現(xiàn)在增強(qiáng)多肽疫苗抗腫瘤效應(yīng)的策略方面，如提高CTL表位的免疫原性，與T輔助表位的聯(lián)用，增加多肽的長(zhǎng)度，克服HLA分子限制性等[6-9]。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，篩選出的10條橫跨WT-p53蛋白70～248段序列、長(zhǎng)度25～30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)肽經(jīng)免疫注射給卵巢癌患者，顯示了較好的安全性和可接受性，并可以誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些重疊肽在動(dòng)物模型中具有使腫瘤消退的作用，在癌癥患者中亦顯示了較好的抗腫瘤免疫效應(yīng)[11-13]。也有文獻(xiàn)[14]報(bào)道單個(gè)長(zhǎng)肽即可有效刺激CD8+、CD4+T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。

作者在預(yù)測(cè)CTL短肽的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，結(jié)合不同預(yù)測(cè)軟件打分結(jié)果篩選得到的較高分值的多肽，多集中在抗原的某一區(qū)域，因此，設(shè)計(jì)中盡量包含這些潛在CTL表位的長(zhǎng)肽。這些長(zhǎng)肽不能直接結(jié)合MHCⅠ分子，必須經(jīng)過(guò)抗原提呈細(xì)胞的加工和提呈，這就在一定程度上避免了短肽引起的免疫耐受現(xiàn)象。該研究中，作者先篩選了3個(gè)腫瘤抗原PLAC1、PL2L60、MAGE-3，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了7條長(zhǎng)肽。在體外ELISPOT實(shí)驗(yàn)里，用這7條長(zhǎng)肽刺激PBMCs，均可誘導(dǎo)分泌IFN-γ的CTL，并且其中的4條肽PLAC1 P42-64、PL2L60 P169-191、 MAGE-3 P101-122、MAGE-3 P152-175優(yōu)于另外3條長(zhǎng)肽。隨后的LDH實(shí)驗(yàn)也證明，這4條肽對(duì)靶細(xì)胞MCF-7的殺傷率在效靶比為501時(shí)可達(dá)到30%左右。

研究中考慮到長(zhǎng)肽被抗原提呈細(xì)胞加工和處理，作者設(shè)計(jì)了與自提呈實(shí)驗(yàn)相應(yīng)的DC荷肽實(shí)驗(yàn)，即從PBMCs里分離出DC并誘導(dǎo)其成熟，讓DC荷載長(zhǎng)肽，再進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，長(zhǎng)肽經(jīng)DC的加工與提呈后，誘導(dǎo)了更多分泌IFN-γ的CTL。這可能有兩方面的機(jī)制：①自然狀態(tài)下DC僅占外周血PBMCs的1%，自提呈實(shí)驗(yàn)里長(zhǎng)肽被加工和提呈的效果不如DC荷肽實(shí)驗(yàn)。②成熟DC高表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ分子和免疫共刺激分子，長(zhǎng)肽可能會(huì)被加工成Th輔助表位，誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞可輔助CD8+T淋巴細(xì)胞的活化，后者分泌IL-2、IFN-γ，維持免疫記憶，也有一定的直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。但該研究只檢測(cè)了分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞，并未具體檢測(cè)是否有CD4+T淋巴細(xì)胞的存在，這也是實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)的地方。體內(nèi)免疫活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4條長(zhǎng)肽均可誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生，其中一條肽MAGE-3 P152-175對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率也達(dá)到30%，另外3條肽對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率在20%～30%。隨后對(duì)小鼠的體重及肝、腎指數(shù)的分析顯示長(zhǎng)肽免疫制劑對(duì)小鼠并無(wú)毒性作用。

綜上所述，來(lái)源于癌睪抗原的長(zhǎng)肽疫苗能夠在體內(nèi)外被抗原提呈細(xì)胞加工和提呈，可以誘導(dǎo)特異性CTL并對(duì)靶細(xì)胞有殺傷作用，所設(shè)計(jì)的長(zhǎng)肽作為一種免疫治療疫苗具有較好的研究?jī)r(jià)值。

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(2016-11-11收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Design and immune activity detection of long peptide vaccine targeted at cancer-testis antigen PLAC1, PL2L60 and MAGE-3

ZHAIWenjie,WUYahong,HANYanlin,LIGuodong,CHENZhenzhen,DUJiangfeng,QIYuanming,GAOYanfeng

SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

tumor immunity;cancer testis antigen;epitope prediction;long peptide

Aim: To design long peptides based on CTL epitope prediction for cancer testis antigen PLAC1, PL2L60 and MAGE-3, and to study the immune activity of the long peptides. Methods: The CTL epitope of PLAC1, PL2L60 and MAGE-3 were predicted using online databases, the long peptides with appropriate length in the epitope region was chosen, and then they were synthesized chemically and purified. Finallyinvitroandinvivoactivity experiments were used to verify if the long peptides had immune activity. Results: HLA-A2 restricted CTL epitopes for PLAC1, PL2L60 and MAGE-3 were predicted, and 7 long peptides were designed. The autopresentation, long peptide-pulsed DC ELISPOT assay and LDH results showed that long peptides PLAC1 P42-64, PL2L60 P169-191, MAGE-3 P101-122 and MAGE-3 P152-175 had better immune activity; the ELISA resultsinvivoshowed that MAGE-3 P152-175 induced more IFN-γ release in HLA-A2.1/Kb transgenic mice,invivoLDH results showed that the spleen lymphocytes from HLA-A2.1/Kb transgenic mice induced by the long peptides PLAC1 P42-64, PL2L60 P169-191, MAGE-3 P101-122 and MAGE-3 P152-175 had higher killing rate on target cells. Conclusion: Four long peptides pointing to cancer testis antigen PLAC1, PL2L60 and MAGE-3 have been successfully identified, which could be used as immunotherapy vaccine in future.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.007

R73

#通信作者，男，1980年10月生，博士，教授，研究方向：抗腫瘤多肽藥物，E-mail：gaoyf@zzu.edu.cn

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81373228；81601448；81571547