miR-199a-3p在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

高 盼，魯照明，劉襄艷，張幸麗，凡 丞，師瑩瑩，侯桂琴

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

miR-199a-3p在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

高 盼，魯照明，劉襄艷，張幸麗，凡 丞，師瑩瑩，侯桂琴#

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

miR-199a-3p；食管鱗癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

目的：探討miR-199a-3p在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法采用Real-time PCR法檢測(cè)miR-199a-3p在5株食管鱗癌細(xì)胞TE1、Eca109、EC9706、KYSE450、KYSE790中的表達(dá)。用siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑將人工合成的miR-199a-3p模擬物 mimics轉(zhuǎn)染Eca109、EC9706細(xì)胞后，采用Real-time PCR法檢測(cè)miR-199a-3p的表達(dá)，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK-8法及雙染法檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力、增殖能力和凋亡率，Western blot檢測(cè)mTOR、p-p70S6K和Bcl-2蛋白的表達(dá)。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照，以轉(zhuǎn)染mimics陰性對(duì)照的細(xì)胞為陰性對(duì)照。結(jié)果miR-199a-3p在5株食管鱗癌細(xì)胞中均有表達(dá)，表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞中miR-199a-3p相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.001)，細(xì)胞克隆形成能力降低(P<0.001)，細(xì)胞增殖能力降低(P<0.001)，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.001)，mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)論miR-199a-3p可能是通過調(diào)節(jié)mTORC1/p70S6K信號(hào)通路來抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

食管癌是一種較常見的消化道惡性腫瘤，我國(guó)90%以上的食管癌患者其病理學(xué)類型為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性的非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA，可通過與靶基因mRNA的非編碼區(qū)域(3’-untranslated region，3’UTR)互補(bǔ)匹配，干擾mRNA分子的翻譯，從而下調(diào)靶基因的表達(dá)[2]。miR-199a-3p是miR-199a的一個(gè)亞基，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。報(bào)道[3]證實(shí)，miR-199a可通過與MeCP2結(jié)合調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路，影響RTT(Rett Syndrome Phenotypes)疾病的發(fā)展過程；通過抑制mTOR和c-Met的表達(dá)而提高肝癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性[4]；也可通過靶向mTOR的3’UTR，抑制mTOR的表達(dá)，從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖[5]；還可通過抑制Met和mTOR的表達(dá)，抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[6]。作者觀察了miR-199a-3p對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、凋亡及mTORC1/p70S6K信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討ESCC發(fā)生發(fā)展確切的分子機(jī)制，為其分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑ESCC細(xì)胞TE1、Eca109、EC9706購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫，KYSE450和KYSE790由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院李晟磊教授惠贈(zèng)，其中TE1和EC9706是低分化細(xì)胞株，Eca109、KYSE450、KYSE790是高分化細(xì)胞株，5株細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人工合成的miR-199a-3p模擬物 mimics、mimics陰性對(duì)照及siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miR-199a-3p引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；GAPDH、mTOR、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)、Bcl-2兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；CCK-8試劑購(gòu)自鄭州德雅科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 5株ESCC細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)的檢測(cè)

分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5株細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄得cDNA，用Real-time PCR法檢測(cè)miR-199a-3p。miR-199a-3p引物序列為：上游5’-GCCGAA CAGTAGTCTGCACAT-3’，下游5’-TATGGTTTT GACGACTGTGTGAT-3’；U6內(nèi)參引物序列為：上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’；U6反轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR 10 μL，dH2O 6.4 μL。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)程序：95 ℃30 s；95 ℃5 s，62 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃5 s，60 ℃60 s，95 ℃1 s；50 ℃30 s。記錄Ct值，按照2-ΔΔCt計(jì)算miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.3轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞增殖、凋亡、miR-199a-3p及mTORC1/p70S6K信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

1.3.1 轉(zhuǎn)染 將適量Eca109和EC9706細(xì)胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%。分別取11 μL預(yù)先配制好的mimics及陰性對(duì)照加入到含有200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無RNA酶EP管中，混勻，室溫孵育5 min，加入適量siRNA-MateTM，混勻，室溫孵育10 min，然后將配制好的轉(zhuǎn)染試劑加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，使mimics及陰性對(duì)照終濃度為100 nmol/L。將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作空白對(duì)照。

1.3.2 miR-199a-3p的檢測(cè) 更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞并提取總RNA，按1.2方法測(cè)定miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后，將各組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1 000個(gè)，每組3個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換一次培養(yǎng)基，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)時(shí)終止培養(yǎng)。棄去原培養(yǎng)基，用PBS洗2～3次，加1 mL甲醇固定30 min，棄去甲醇，再用PBS洗2～3次，加1 mL 10 g/L結(jié)晶紫染色30 min，最后用PBS沖洗直至細(xì)胞周圍無明顯紫色為止，室溫晾干，拍照，用Image J進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞增殖的檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)。將適量細(xì)胞接種至96孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞融合度在30%～50%。第2天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法同1.3.1。轉(zhuǎn)染6、24、48、72和96 h后，加入CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后測(cè)定450 nm處的吸光度值，表示細(xì)胞增殖能力。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗1～2次，加1 mL 1×Binding Buffer重懸，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用適量1×Binding Buffer重懸，再加5 μL Annexin V-FITC室溫孵育10 min，加5 μL PI室溫孵育5 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。整個(gè)操作過程應(yīng)避光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 mTOR、p-p70S6K和Bcl-2蛋白檢測(cè) 轉(zhuǎn)染72 h后收集各組細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)mTOR、 p-p70S6K和Bcl-2蛋白。蛋白上樣量均為20 μg，一抗稀釋比例均為11 000，二抗稀釋比例均為110 000。電泳條件為80 V 40 min，120 V 1 h。轉(zhuǎn)膜條件為300 mA 2 h。50 g/L脫脂奶粉PBST封閉2 h，4 ℃過夜。次日用PBST洗10 min×3次，室溫振搖2 h。然后PBST洗10 min×3次，ECL超敏發(fā)光液孵育1 min，曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5株ESCC細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TE1、Eca109、EC9706、KYSE450、KYSE790細(xì)胞中miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.351±0.549)、(1.362±0.130)、(1.368±0.279)、(1.346±0.181)、(1.352±0.860)，5組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.001，P>0.999)，提示miR-199a-3p的表達(dá)水平與ESCC細(xì)胞分化程度無關(guān)。

2.2轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)見表1。轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞中miR-199a-3p相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照和空白對(duì)照顯著升高(P<0.05)。

表1 轉(zhuǎn)染mimics的Eca109、EC9706細(xì)胞中miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量

*:與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

2.3轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞的克隆形成能力見圖1、表2。轉(zhuǎn)染mimics后Eca109和EC9706細(xì)胞克隆形成能力較空白對(duì)照和陰性對(duì)照降低(P<0.05)。

2.4轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞的凋亡情況見表3。轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照和陰性對(duì)照升高(P<0.05)。

2.5轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞的增殖能力見表4、5。轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞增殖能力較空白對(duì)照和陰性對(duì)照降低(P<0.05)。

A～C：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、mimics組Eca109細(xì)胞；D～F：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、mimics組EC9706細(xì)胞。 圖1 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

組別nEca109EC9706空白對(duì)照組3450.0±26.5323.3±15.3陰性對(duì)照組3443.3±15.3313.3±15.3mimics組3160.0±20.0*146.7±15.3*F184.975126.619P<0.001<0.001

*:與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

表3 3組細(xì)胞凋亡率的比較 %

*:與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

表4 Eca109細(xì)胞增殖能力測(cè)定結(jié)果(n=3)

*:與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

表5 EC9706細(xì)胞增殖能力測(cè)定結(jié)果(n=3)

*:與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，P<0.05。

2.6轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白的表達(dá)見圖2。轉(zhuǎn)染mimics的Eca109和EC9706細(xì)胞中mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白表達(dá)水平均降低。

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：mimics組。 圖2 mTOR、p-p70S6K及Bcl-2蛋白的檢測(cè)

3 討論

1993年，Lee等[7]首先在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)可時(shí)序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的miRNA——lin-4，之后Reinhart等[8]又在同類線蟲中發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)異時(shí)性開關(guān)基因let-7，接著人們相繼在細(xì)菌、動(dòng)植物與人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量miRNA。近年來研究[2-9]發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅在生物體細(xì)胞分化、增殖、代謝以及免疫應(yīng)答等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，而且與腫瘤、心腦血管疾病、代謝性疾病、神經(jīng)性疾病、內(nèi)分泌疾病及免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤中，miRNA通常以癌基因或抑癌基因的角色參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Huo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-144a-3p可通過靶向mTOR抑制人唾液腺腺樣癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Chen等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-451在多種結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與mTORC1的活性和FSCN1的表達(dá)密切相關(guān)，miR-451高表達(dá)可抑制AMPK的活性，導(dǎo)致mTORC1過度激活和FSCN1高表達(dá)，從而使細(xì)胞具有較高的遷移和增殖能力，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。Janaki等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-15/16可通過抑制p70S6K1的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖并使細(xì)胞周期停留在G1階段。

miR-199a定位在人染色體19q13.2[13]。miR-199a-3p在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，如卵巢癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳頭狀甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤、骨肉瘤等，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[9-16]。Troppan等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-199a和miR-497可增強(qiáng)彌散型B淋巴細(xì)胞瘤對(duì)化療的敏感性，延長(zhǎng)患者的生存期；Tian等[15]發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p和miR-34a可通過影響p53信號(hào)通路誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡；Peng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖。該研究結(jié)果證實(shí)，ESCC細(xì)胞中也存在miR-199a-3p的表達(dá)；上調(diào)其表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞增殖并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低mTORC1/p-p70S6K信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，說明miR-199a-3p可能是通過調(diào)節(jié)mTORC1/p-p70S6K信號(hào)通路來影響ESCC細(xì)胞的增殖和凋亡。

目前有關(guān)miR-199a-3p在ESCC中的研究較少，該研究也僅對(duì)其進(jìn)行了體外研究?？傊琺iR-199a-3p在ESCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，深入探討miR-199a-3p在ESCC中的作用及相關(guān)機(jī)制可能為ESCC的臨床診斷和分子治療提供新的靶標(biāo)和策略。

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(2016-12-03收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expression of miR-199a-3p and its effects on cell proliferation and apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells

GAOPan,LUZhaoming,LIUXiangyan,ZHANGXingli,FANCheng,SHIYingying,HOUGuiqin

SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

miR-199a-3p;esophageal squamous cell carcinoma;cell proliferation;cell apoptosis

Aim: To investigate the expression of miR-199a-3p in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) cells and its effects on cell proliferation and apoptosis. Methods: The expression of miR-199a-3p in five ESCC cell lines(TE1, Eca109, EC9706, KYSE450, KYSE790) was detected by Real-time PCR. miR-199a-3p mimics was transfected into Eca109 and EC9706 cells, respectively by siRNA-MateTM, and then the colony capacity, proliferation capacity and apoptosis rate were detected by colony formation assay, CCK-8 assay and Annexin V-FITC and PI staining method, respectively, the expressions of mTOR, p-p70S6K and Bcl-2 protein were detected by Western blot. Cells without transfection were the blank control, and cells transfected with negative mimics were the negative control.Results: miR-199a-3p expressed in five ESCC cell line cells, and the expression level had no significant difference(P>0.05). Compared with negative control and blank control, the expression level of miR-199a-3p in Eca109 and EC9706 cells transfected with miR-199a-3p mimics increased(P<0.001), the colony formation capacity and proliferation capacity decreased(bothP<0.001), the apoptosis rate increased(P<0.001), and the protein expressions of mTOR, p-p70S6K and Bcl-2 decreased. Conclusion: miR-199a-3p might inhibit cell proliferation and promote cell apoptosis in ESCC cells through mTORC1/p70S6K signal pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.001

R735.1

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 30901778；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 162300410122

#通信作者，女，1977年6月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)，E-mail:hougq@zzu.edu.cn