磷酸奧司他韋膠囊有效成分含量測(cè)定方法研究

陳麗，馬書玉

摘 要：目的：通過文獻(xiàn)及方法學(xué)研究確立磷酸奧司他韋膠囊有效磷酸奧司他韋的含量測(cè)定方法。方法：HPLC法。色譜柱為全多孔硅膠微粒健合C8色譜柱（46mm×25cm，5？滋m）；流動(dòng)相為甲醇：乙腈：磷酸二氫鉀-氫氧化鉀緩沖溶液（245：135：620）；等度洗脫；流速：1.2ml/min；UV檢測(cè)波長(zhǎng)：207nm；進(jìn)樣量：15μl；色譜柱溫度：50℃。結(jié)果：有效成分磷酸奧司他韋進(jìn)樣量在3.0234～30.234μg與峰面積A呈良好的線性關(guān)系（r值0.9999），加樣回收率為99.67%，RSD為1.10%；結(jié)論：方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明該方法測(cè)定磷酸奧司他韋膠囊含量準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：磷酸奧司他韋膠囊；HPLC；含量測(cè)定

磷酸奧司他韋膠囊最早在1999年10月上市，原研藥商品名達(dá)菲，生產(chǎn)廠家為羅氏制藥。磷酸奧司他韋是其活性代謝產(chǎn)物的藥物前體，其活性代謝產(chǎn)物（奧司他韋羧酸鹽）是選擇性的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。神經(jīng)氨酸酶是病毒表面的一種糖蛋白酶，其活性對(duì)新形成的病毒顆粒從被感染細(xì)胞中釋放和感染性病毒在人體內(nèi)進(jìn)一步播散至關(guān)重要。磷酸奧司他韋的活性代謝產(chǎn)物能夠抑制甲型和乙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性。在體外對(duì)病毒神經(jīng)氨酸酶活性的半數(shù)抑制濃度低至納克水平。在體外觀察到活性代謝產(chǎn)物抑制流感病毒生長(zhǎng)，在體內(nèi)也觀察到其抑制流感病毒的復(fù)制和致病性。本品通過抑制病毒從被感染的細(xì)胞中釋放，從而減少了甲型或乙型流感病毒的播散。對(duì)自然獲得的和實(shí)驗(yàn)室性流行性感冒進(jìn)行的研究顯示：應(yīng)用磷酸奧司他韋并沒有影響人體對(duì)感染產(chǎn)生正常的體液免疫反應(yīng)。對(duì)滅活疫苗的抗體反應(yīng)并沒有受磷酸奧司他韋治療的影響。目前國(guó)內(nèi)市面上主要有羅氏生產(chǎn)的達(dá)菲和國(guó)產(chǎn)達(dá)菲即磷酸奧司他韋膠囊兩種。

本文參考了國(guó)內(nèi)外約17篇文獻(xiàn)以及美國(guó)36版藥典，通過方法學(xué)驗(yàn)證建立了磷酸奧司他韋的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀：Waters2694-2996型，分析天平：METTLE XS205型。磷酸奧司他韋對(duì)照品（批號(hào)101096-201502）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。流動(dòng)相用甲醇、乙腈為色譜純；磷酸二氫鉀和氫氧化鉀為分析純；水為超純水；樣品磷酸奧司他韋膠囊為公司自制（中試級(jí)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]：

色譜柱：全多孔硅膠微粒健合C8色譜柱（46mm×25cm，5？滋m）；柱溫：50℃

溶液A：將6.8g磷酸二氫鉀溶解在980mL水中。用1M氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)至pH6.0，用水稀釋至1L。

流動(dòng)相：甲醇：乙腈：溶液A（245：135：620）。

稀釋劑：甲醇：乙腈：水（245：135：620）。

波長(zhǎng)：207nm。

流速：1.2ml/min，進(jìn)樣量：15μl。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液、對(duì)照品溶液制備

對(duì)照品儲(chǔ)備液：稱取磷酸奧司他韋對(duì)照品100.78mg，置10mL量瓶中，加入稀釋劑使溶解并定容至刻度，制得10mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

對(duì)照品溶液：精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液1ml至10ml容量瓶中，加稀釋劑至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備：取磷酸奧司他韋膠囊20粒，取內(nèi)容物混勻并研成細(xì)粉，精密稱取該粉末（約相當(dāng)于奧司他韋50mg），置50mL容量瓶中，加入稀釋劑20ml適量，超聲波處理20分鐘，放冷，加稀釋劑至刻度后，搖勻，離心，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

按照2.1項(xiàng)色譜方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液0.2ml，0.6ml，1ml，1.4ml，1.8ml，2.0ml置10ml容量瓶中，分別加稀釋劑至刻度，搖勻，制成0.2、0.6、1、1.4、2.0mg/ml的對(duì)照品溶液（線性考察）。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品溶液濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察線性關(guān)系，計(jì)算回歸方程得：A=959265C+3093.8 r=0.9999。試驗(yàn)結(jié)果如下表1。

結(jié)果表明：磷酸奧司他韋濃度（以?shī)W司他韋計(jì)）在0.2016～2.0156mg/ml（進(jìn)樣體積15μl），即進(jìn)樣量在3.0234～30.234μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)：精密量取磷酸奧司他韋對(duì)照品溶液依照2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，每針15μl，記錄色譜圖及峰面積，以6針峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為評(píng)測(cè)指標(biāo)，考察精密度。結(jié)果：磷酸奧司他韋對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD結(jié)果為0.35%小于2%，說明精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)：按照上述2.3項(xiàng)供試品溶液制備方法，取同一批次磷酸奧司他韋膠囊樣品（規(guī)格75mg，批號(hào)1701071）平行制備6份供品試液， 取供試品溶液及對(duì)照品溶液各15μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算磷酸奧司他韋的含量。結(jié)果：6平行份樣品的磷酸奧司他韋含量RSD值為 0.92%，小于2%表明供試品制備方法可靠穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

2.4.4 回收率試驗(yàn)：取磷酸奧司他韋膠囊20粒（批號(hào)1701071），取內(nèi)容物混勻并研成細(xì)粉，精密稱取該粉末（約相當(dāng)于奧司他韋25mg）及對(duì)照品按高、中、低三個(gè)量（每個(gè)量3個(gè)平行樣，共9份樣品）分別置于9個(gè)50mL容量瓶中，分別加入稀釋劑20ml適量，超聲波處理20分鐘，放冷，加稀釋劑至刻度后，搖勻，離心，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。分別精密量取本項(xiàng)下供試品溶液和上述2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液各15μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得出含量和回收率。磷酸奧司他韋的加樣回收率（以?shī)W司他韋計(jì)）結(jié)果：低濃度回收率平均值為99.49%，中濃度回收率平均值為98.68%，高濃度回收率平均值為100.83%。所有結(jié)果均在98.41%～101.72%之間，高中低三個(gè)濃度9個(gè)供試品回收率數(shù)據(jù)的平均值為99.67%，RSD為1.10%小于2%；所有結(jié)果均符合要求，標(biāo)明該檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確、可靠。

2.5 樣品測(cè)定

應(yīng)用上述建立的磷酸奧司他韋含量測(cè)定方法對(duì)穩(wěn)定性研究用自制中試級(jí)別的四批磷酸奧司他韋膠囊樣品的含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果分別為：75.05mg/片、75.02mg/片、75.09mg/片、75.11mg/片，結(jié)果均符合規(guī)定。通過實(shí)際測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了方法得可靠性。

3 討論

通過方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)建立了磷酸奧司他韋膠囊含量測(cè)定方法。并證明該方法穩(wěn)定可靠。另外，在研究實(shí)驗(yàn)過程中主要遇到以下兩個(gè)問題值得討論。一是部分文獻(xiàn)使用C18色譜柱，而美國(guó)藥典選擇了C8色譜柱。二者的區(qū)別在于C18色譜柱碳鏈更長(zhǎng)，保留性更好，C8高疏水性分析物、類固醇、脂類等大分子樣品分析；而C18則適合中等極性、非極性等小分子樣品分析。因此，對(duì)于磷酸奧司他韋，選擇C8更為合理。二是部分文獻(xiàn)流動(dòng)相的水相為磷酸鈉鹽，而美國(guó)藥典為磷酸二氫鉀。通過比較試驗(yàn)，對(duì)于磷酸奧司他韋的分析，只要二者摩爾濃度一致，對(duì)色譜表現(xiàn)沒有明顯區(qū)別。

參考文獻(xiàn)

[1]美國(guó)藥典，USP36.