1株海綿共生真菌代謝產物的研究

龍海林　李康強　　許文東　　傅玉萍

[摘要] 綜合運用各種色譜分離技術對海綿共生真菌Emericella variecolor的固體大米培養(yǎng)基發(fā)酵產物進行化學成分研究，利用各種波譜技術進行化學結構鑒定。結果從該真菌的發(fā)酵產物中分離得到6個單體化合物，分別鑒定為 （+）2acetyldihydroterrein （1），（+）3acetyldihydroterrein（2），anditomin（3），andilesin A（4），andilesin C（5），andilesin B（6）。其中化合物1和2為新化合物。

[關鍵詞] 海綿共生真菌； Emericella variecolor； 化學成分

Study on metabolites from a spongederived fungus

LONG Hailin， LI Kangqiang， XU Wendong， FU Yuping*

（National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of Traditional Chinese Medicine，

Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China）

[Abstract] We have carried out the investigation on a spongederived fungus，which was identified as Emericella variecolor from the south sea of China. Two new chemical constituents，（+）2acetyldihydroterrein （1） and （+）3acetyldihydroterrein （2），with four known compounds，anditomin （3），andilesin A （4），andilesin C （5） and andilesin B （6），were isolated from this fungus by column chromatography over silica gel， Sephadex LH20， and ODS. The structures of 1 and 2 were elucidated by spectroscopic methods including NMR，HRESIMS，and CD.

[Key words] spongederived fungus； Emericella variecolor； chemical constituents

海洋真菌兼具種屬多樣、分布廣、代謝途經復雜的特性。據(jù)統(tǒng)計，已知約71.2萬種海洋真菌可棲身諸如水體、底泥、砂石等無機質生境，也可共附生于如藻類、無脊椎動物、魚類等活體[1]。海綿共生真菌所處的生態(tài)環(huán)境兼具陸地生態(tài)系統(tǒng)無法比擬的高壓、高鹽、低光照和寡營養(yǎng)的物理脅迫，也存在與其宿主長期協(xié)同進化過程中生物選擇脅迫，這種脅迫使兩者之間發(fā)生很多次基因重組或改變[2]，其互擾性和易擾性直接影響它們的次生代謝[34]。迄今為止，國內外學者已從海洋動植物共生真菌中發(fā)現(xiàn)一些活性分子，有些具有罕見的結構，如從海綿共附生真菌Penicillium terrestre中發(fā)現(xiàn)的膽堿酯酶抑制劑sorbiterrin A[5]，以及從海綿共附生細菌Ruegeria sp.中發(fā)現(xiàn)的新穎抗菌環(huán)肽類成分[6]等。國內外學者早在二十世紀六七十年代就已經開始對真菌Emericella variecolor進行化學成分研究，發(fā)現(xiàn)了多種類型的化合物，如酮類[7]、萜類[89]、多烯吡喃酮類[10]、苯甲醇類[11]等。為了獲得更多的活性化合物，本實驗采用大米固體培養(yǎng)基進行微生物發(fā)酵，在正常室溫條件下培養(yǎng)海綿共生真菌Emericella variecolor 30 d，再用乙酸乙酯萃取大米培養(yǎng)基，之后對提取物進行化學成分分離。在提取物中分離得到6個單體化合物，其中化合物1和2為新化合物，其他4個為已知化合物（圖1）。

1 材料

UV譜用JASCO V550 紫外可見分光光度儀測定；旋光值用Autopol Ⅲ automatic polarimeter型旋光儀測定；HRESIMS用Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL型質譜儀測定；NMR用Bruker AvanceⅢ 400 MHz核磁共振儀測定；分析型HPLC用Shimadzu LC20AD 液相色譜儀測定，檢測器為SPDM20A；半制備使用Alltech LabAlliance Series Ⅲ儀器，配備UV檢測器。

硅膠薄層分析使用青島海洋化工廠的GF254薄層預制板；柱色譜硅膠（200～300目）為青島海洋化工廠產品；常壓反相ODS柱色譜使用的C18填料為日本YMC公司產品；凝膠柱色譜Sephadex LH20使用的是Pharmacia公司產品；分析用HPLC色譜柱為Thermo Scientific BDS Hypersil的C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；半制備柱為Waters SunfireTM C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；所有試劑為分析純或色譜純。

實驗用菌種E. variecolor分離自中國南海采集到的海綿，菌種保藏于北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。

2 提取與分離

菌株E. variecolor在經過30 d大米培養(yǎng)基發(fā)酵后，將大米發(fā)酵物充分破碎，用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮后得到粗提物20 g，粗提物用80%甲醇混懸后用石油醚萃取3次，減壓回收甲醇水部位得到粗浸膏約10 g。粗浸膏首先用常壓ODS柱色譜分離，洗脫劑為30%，40%，50%，60%，70%甲醇梯度洗脫，得到5個流分（Fr.1～Fr.5）。Fr.3（5.2 g）再次進行硅膠 （200～300目，300 g） 柱色譜，以CH2Cl2CH3OH（100∶1，50∶1，30∶1，15∶1，10∶1）梯度洗脫，相同組分合并，得到6個流分（Fr.3.1～Fr.3.6），其中Fr.3.3為化合物3（1.8 g），F(xiàn)r.3.5為化合物4（1.6 g），F(xiàn)r.3.1（0.5 g）再經半制備液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色譜分離，得到化合物1（8 mg）和2（10 mg），F(xiàn)r.3.4（180 mg）和Fr.3.6（160 mg）分別用半制備液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色譜純化，分別得到化合物5（52 mg）和化合物6（48 mg）。endprint

3 結構鑒定

化合物1 為白色粉末；[α]20D+ 40.1（c 1.15，MeOH）；高分辨電噴霧質譜（HRESIMS）顯示其準分子離子峰為m/z 221.079 5 [M+Na]+（計算值 C10H14O4Na，221.079 0），說明其相對分子質量為198，分子式為C10H14O4，不飽和度為4；首先，分析1HNMR圖譜，該化合物的氫譜與化合物dihydroterrein[12]非常相似，只多了1個甲基信號δH 2.11（3H，s，H10），可能為乙?；募谆?，根據(jù)13CNMR和HMBC圖譜發(fā)現(xiàn)，H10與羰基碳（C9）有相關信號，可確定化合物中含有1個乙?；琀MBC圖譜中，H2[δH 5.00（d，J=3.0 Hz）]與C9有相關信號，可確定乙酰基通過氧原子與C2相連（表1）；化合物1的相對構型可根據(jù)H2與H3的偶合常數(shù)J=3.0 Hz來確定，可知H2與H3處于反式，絕對構型通過比較計算ECD與實測ECD來確定，C2與C3分別為R和S構型，命名為（+）2acetyldihydroterrein（圖2）。

4 討論

21世紀前，海綿一直是發(fā)現(xiàn)海洋天然產物的最主要生物來源[1620]，發(fā)現(xiàn)了許多化學結構新穎，生物活性顯著、作用機制獨特的功能小分子，其中的一些已經作為新藥候選先導化合物，處于臨床前或臨床研究階段；海綿共生真菌作為海綿宿主的重要組成部分，兩者互相協(xié)作，共同適應海洋復雜的生存環(huán)境，海綿為真菌提供營養(yǎng)物質和寄生產所，共生真菌為海綿抵御外來環(huán)境的威脅而釋放一些化學物質；海綿共生真菌體內蘊藏著巨大的生物合成基因簇，大力挖掘海綿共生真菌的天然產物合成潛力，是獲得活性化學成分的又一寶貴途徑，總之，海綿及其共生微生物是開發(fā)先導化合物的重要資源。

[參考文獻]

[1] Rateb M E，Ebel R. Secondary metabolites of fungi from marine habitats[J]. Nat Prod Rep， 2011，28（2）： 290.

[2] Dyall S D，Brown M T，Johnson P J. Ancient invasions： from endosymbionts to organelles[J]. Science，2004，304： 253.

[3] PartidaMartinez L P，Hertweck C. Pathogenic fungus harbours endosymbiotic bacteria for toxin production[J]. Nature，2005，437（7060）： 884.

[4] Debbab A，Aly A H，Proksch P. Endophytes and associated marine derived fungi ecological and chemical perspectives[J]. Fungal Dives，2012，57（1）： 45.

[5] Li C，Zhu T J，Ding Y Q. Sorbiterrin A，a novel sorbicillin derivative with cholinesterase inhibition activity from the marinederived fungus Penicillium terrestre[J]. Tetrahedron Lett，2012，53（3）： 325.

[6] Mitova M，Popov S，Rosa S D. Cyclic peptides from a ruegeria strain of bacteria associated with the sponge Suberites domuncula[J]. J Nat Prod，2004，67（7）： 1178.

[7] Bringmann G，Lang G，Steffens S，et al. Evariquinone，isoemericellin，and stromemycin from a sponge derived strain of the fungus Emericella variecolor[J]. Phytochemistry，2003，63： 437.

[8] Wei H，Itoh T，Kinoshita M，et al. Cytotoxic sesterterpenes，6epiophiobolin G and 6epiophiobolin N，from marine derived fungus Emericella variecolor GF10[J]. Tetrahedron，2004，60： 6015.

[9] Liangsakul J，Pornpakakul S，Sangvichien E，et al. Emervaridione and varioxiranediol，two new metabolites from the endophytic fungus，Emericella variecolor[J]. Tetrahedron Lett，2011，52： 6427.

[10] Adachi H，Doi H，Kasahara Y，et al. Asteltoxins from the entomopathogenic Fungus Pochonia bulbillosa 8H28[J]. J Nat Prod，2015，78：1730.

[11] Wu Q， Wu C M， Long H L， et al. Varioxiranols AG and 19Omethyl22methoxypreshamixanthone， PKS and hybrid PKSderived metabolits from a spongeassociated Emericella variecolor fungus[J]. J Nat Prod， 2015，78：2461.endprint

[12] Malmstrm J，Christophersen C，Barrero A F，et al. Bioactive metabolites from a marinederived strain of the fungus Emericella variecolor[J]. J Nat Prod，2002，65：364.

[13] Simpson T J. Biosynthesis of highly modified meroterpenoids in aspergillus variecolor. Incorporation of 13Clabelled acetates and methionine into anditomin and andilesin C[J]. Tetrahedron Lett，1981，22（38）： 3785.

[14] Simpson T J，Walkinshaw M D. Anditomin，a new C25 metabolite from Aspergillus variecolor[J]. J C S Chem Comm，1981，1981（17）： 914.

[15] Simpson T J. Studies on fungal metabolites. Part 1. The structures of andibenins A and C，and andilesinsA，B，and C，meroterpenoids from Aspergillus variecolor [J]. J Chem Soc， Perkin Trans Ⅰ，1979，10（9）： 2118.

[16] John W B，Brent R C，Robert A K，et al. Marine natural products[J]. Nat Prod Rep，2014，31：160.

[17] John W B，Brent R C，Robert A K，et al. Marine natural products[J]. Nat Prod Rep，2013，30： 237.

[18] John W B，Brent R C，Robert A K，et al. Marine natural products[J]. Nat Prod Rep，2012，29： 144.

[19] Jonathan C M. Marine natural products： sythetic aspects[J]. Nat Prod Rep，2013，30：783.

[20] John W B，Brent R C，Robert A K，et al. Marine natural products[J]. Nat Prod Rep， 2011，28：196.

[責任編輯 丁廣治]endprint