鄧康麗,葛利本,陳玉丙,閆文星,吳達軍
(1.三六三醫(yī)院體部伽馬刀治療中心,四川 成都 610041;2.吉林省人民醫(yī)院放療科,吉林 長春 130021;3.吉林大學第二醫(yī)院放療科,吉林 長春 130041)
白介素-17對人宮頸腺癌細胞株HeLa體外增殖的影響
鄧康麗1,葛利本2,陳玉丙3,閆文星3,吳達軍1
(1.三六三醫(yī)院體部伽馬刀治療中心,四川 成都 610041;2.吉林省人民醫(yī)院放療科,吉林 長春 130021;3.吉林大學第二醫(yī)院放療科,吉林 長春 130041)
目的觀察IL-17對人宮頸腺癌細胞株HeLa細胞體外增殖的影響,并探討可能的機制。方法分別采用0、1、10 、50 、100 ng/ml的rIL-17刺激人宮頸腺癌HeLa細胞24小時,MTT法檢測細胞增殖情況,根據(jù)篩選出的濃度進行后續(xù)實驗。用rIL-17(0、50、100 ng/ml)刺激經饑餓誘導凋亡的細胞24小時,F(xiàn)CM法檢測細胞凋亡情況;用rIL-17刺激細胞48小時,檢測促血管生成因子VEGF mRNA和蛋白的表達量。結果rIL-17刺激細胞一定時間后,1、10及100 ng/ml濃度組細胞增殖無明顯變化,50 ng/ml組細胞增殖明顯增加(P< 0.01);50 ng/ml組細胞的晚期凋亡率和總凋亡率較正常對照組均明顯下降(P< 0.01;P< 0.05),100 ng/ml組細胞下降更為顯著(P< 0.01);50 ng/ml和100 ng/ml兩組細胞內VEGF mRNA和蛋白的表達量均升高,以50 ng/ml組最為明顯(P< 0.05)。結論IL-17可能通過抑制細胞凋亡及上調VEGF mRNA和蛋白水平的表達促進宮頸腺癌HeLa細胞體外增殖。
白細胞介素-17;宮頸腫瘤;細胞增殖;血管內皮生長因子
宮頸癌是全球女性第二大常見且死亡率極高的惡性腫瘤,每年有超過27萬人死于宮頸癌[1]。其中,宮頸腺癌約占宮頸癌總數(shù)的15%,預后較差,發(fā)病率穩(wěn)中有升,尤其在年輕女性[2]。其具有與鱗癌不同的生長模式、分子基礎和放化療敏感性[3],影響疾病的進展及預后。因此,發(fā)現(xiàn)新的疾病監(jiān)測指標和找到新的治療策略迫在眉睫。
白細胞介素17(IL-17)是1993年發(fā)現(xiàn)的一種功能強大的炎癥因子,參與機體特異和非特異性免疫。研究表明其在多種惡性腫瘤中過表達。但在癌癥中的作用及內在機制尚未完全闡明[4],其發(fā)揮促瘤還是抑瘤作用,尚有爭議[4,5]。HPV病毒感染是宮頸癌最重要的致病因素,尤其是HPV-16/18基因型[6,7],但只有少數(shù)HPV感染導致持續(xù)病變或進展為惡性腫瘤,這意味著必定存在其他因素參與其發(fā)病機制[8]。目前研究認為炎癥在腫瘤進展中起重要作用[5]。國內外關于IL-17與宮頸癌關系的報道甚少,尚未證實其是否可以促進宮頸癌細胞的增殖。本文通過體外實驗,觀察IL-17對宮頸腺癌HeLa細胞增殖的影響,探討其可能的內在機制,為IL-17在宮頸腺癌的研究提供實驗基礎。
1.1主要材料及儀器人宮頸腺癌細胞株HeLa由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院唐敖慶特聘教授實驗室惠贈;重組人白細胞介素17(rIL-17)購自美國Peprotech公司;血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)一抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、β-Actin一抗購自美國ABGENT公司;流式細胞儀購自美國Sigma公司;RT-PCR 擴增儀購自美國ABI公司。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng) 用10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,于5% CO2,37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。 實驗前一天換液,每個實驗重復三次。
1.2.2MTT實驗檢測HeLa細胞增殖情況 選對數(shù)生長期細胞,制成單細胞懸液,按每孔4×103個細胞200 μl培養(yǎng)液的濃度接種于96孔板,按rIL-17的濃度設5個組:0 (空白對照組)、1、10、50、100 ng/ml,每組設5個復孔。次日用不同濃度的rIL-17低血清培養(yǎng)液(含2% FBS的DMEM)200 μl繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出96孔板,每孔加入20 μl無菌MTT(5 mg/ml)孵育4 h,吸棄孔板內的培養(yǎng)液,每孔中加入150 μl DMSO,在室溫下震蕩10 min,用酶標儀測定490 nm波長處每孔的吸光度值(OD),根據(jù)吸光度值,計算細胞相對增殖率(RGR),RGR=(實驗組OD值均值/空白對照組OD均值)×100%。
1.2.3FCM法檢測HeLa細胞凋亡情況 將細胞按每孔2.5 ml培養(yǎng)液中含2×105個細胞接種于6孔板,根據(jù)MTT實驗結果篩選的IL-17刺激濃度,設3個實驗組(空白對照組、50 ng/ml rIL-17組、100 ng/ml rIL-17組)及3個調試組。調試組用于上機檢測前調試儀器,由3組正常細胞組成。次日,用含相應濃度rIL-17的無血清培養(yǎng)液2.5 ml饑餓培養(yǎng)24 h。分別收集各組細胞,1 h內完成上機檢測。
1.2.4RT-PCR法檢測HeLa 細胞VEGF mRNA表達 將細胞按每孔2.5 ml培養(yǎng)液中含1×105個細胞接種于6孔板中,同前設3個組,次日用不同濃度的rIL-17低血清培養(yǎng)液2.5 ml培養(yǎng)細胞48 h,分組收集細胞,提取細胞總RNA,將總RNA電泳和測定濃度后,用RT-PCR法擴增目的基因片段。逆轉錄條件:37 ℃反應1 h,將逆轉錄的cDNA作為模板,PCR擴增獲得目的基因片段,人VEGF-A基因上游引物序列:ATGACGAGGGCCTGGAGTGTG,下游引物序列:CCTATGTGCTGGCCTTGGTGAG,產物91 bp;人 GAPDH(內參)基因上游引物序列:TGTTGCCATCAATGACCCCTT,下游引物序列:CTCCACGACGTACTCAGCG,產物202 bp。PCR擴增條件:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。PCR結束后,取產物電泳檢測,電泳結束,用BIO-RAD凝膠成像分析儀照相及Quantity One軟件進行灰度分析,VEGF mRNA的表達量=VEGF條帶灰度值/GADPH(內參)條帶灰度值。
1.2.5Western blot法檢測HeLa細胞VEGF蛋白的表達 將細胞按每孔2.5 ml培養(yǎng)液中含2×105個細胞的密度接種至6孔板,同前設3個組。次日用相應濃度的rIL-17低血清培養(yǎng)液2.5 ml繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h,分別收集各組細胞,采用反復凍融的方法提取細胞總蛋白,蛋白定量后,行SDS-PAGE分離蛋白,并將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,4 ℃封閉過夜后,根據(jù)蛋白Marker的指示,剪下目的條帶及β-actin內參條帶所在的膜并標記膜的正反面,目的條帶加入一抗兔抗人VEGF多克隆抗體(1:250稀釋),搖床上37 ℃孵育2.5 h后,加入二抗辣根過氧化物酶(HPR)標記山羊抗兔多克隆抗體(1:2000 稀釋),搖床上37 ℃孵育2 h,以β-actin作為對照,β-actin內參條帶加入內參蛋白一抗(1:2000 稀釋),搖床上37 ℃孵育2.5 h后,加入二抗HRP標記山羊抗鼠多克隆抗體(1:2000 稀釋),37 ℃孵育2 h,最后采用ECL顯色,通過Quantitiy One灰度分析軟件進行分析,VEGF蛋白量= VEGF 條帶灰度值/β-actin(內參)條帶灰度。
1.3統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩均數(shù)間比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1MTT實驗檢測HeLa細胞增殖情況實驗組OD值均大于正常對照組,RGR均大于100%,其中50 ng/ml組OD值及RGR顯著高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01),其它濃度對細胞的增殖影響不顯著(P> 0.05),見表1。根據(jù)實驗結果,并結合IL-17在其他瘤種的研究情況,選擇50、100 ng/ml兩個濃度組完成后續(xù)實驗。
表1 MTT法測定不同濃度rIL-17刺激24 h后HeLa細胞的增殖情況
與空白對照組相比,*P< 0.01
2.2FCM法檢測HeLa細胞凋亡情況50、100 ng/ml組細胞晚期凋亡率及總凋亡率均明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義,50、100 ng/ml組的早期凋亡率,相比于對照組,差異均無統(tǒng)計學意義(表2,圖1)。
表2 FCM 法檢測rIL-17 刺激24 h后HeLa細胞的凋亡情況 (%)
與空白對照組相比,*P< 0.05,**P< 0.01
2.3VEGFmRNA和蛋白的表達情況實驗組中細胞VEGF mRNA(表3,圖2a)及蛋白的表達量(表4,圖2b)均高于對照組,以50 ng/ml 組最為明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。
表3 rIL-17處理48 hVEGF的表達情況
與空白對照組比較,*P< 0.05
圖1 流式細胞儀測定rIL-17刺激 24 h后HeLa細胞凋亡情況
圖2 VEGFmRNA和蛋白的表達水平 a:RT-PCR檢測mRNA表達;b:Western blot法檢測蛋白表達 (1:空白對照組;2:50 ng/ml rIL-17組;3:100 ng/ml rIL-17組)
大量研究證明炎癥在腫瘤進展中起重要作用[5],而IL-17作為功能強大的炎癥因子,在腫瘤的進展中扮演著重要角色[9]。但關于IL-17與宮頸癌的關系,國內外文獻報道較少。1999年,Tartour 等[8]用IL-17cDNA轉染宮頸癌HeLa細胞再移植到裸鼠體內,發(fā)現(xiàn)腫瘤顯著地生長。Vidal 等[10]檢測宮頸癌標本發(fā)現(xiàn),相比于感染其它基因型,IL-17在感染HPV-16/18的宮頸癌組織中高表達。近年研究認為[11],IL-17和其它細胞因子如轉化生長因子β(TGF-β),IL-6,IL-23一起促進Th17/Treg比值失衡,并通過影響Th17/Treg失衡促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Zhang 等[12]研究同樣發(fā)現(xiàn)Th17/Treg失衡可能參與宮頸癌的發(fā)展進程。但該研究并未闡明IL-17在此過程中的作用。Punt[13]在宮頸鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)IL-17的增高與疾病的不良預后顯著相關,而Th17細胞與宮頸鱗癌患者生存改善密切相關。國內文獻表明宮頸癌患者血清中IL-17的水平較健康對照組明顯升高,IL-17水平與腫瘤分化程度呈負相關,與疾病分期成正相關[14]。HPV陽性宮頸癌患者血清中IL-17的含量比陰性患者明顯增高[15]。近年的研究更多集中在Th17細胞(IL-17的主要來源)。對于IL-17是否參與宮頸癌尤其是感染高危型HPV腺癌的發(fā)病機制還不清楚。
實驗中,MTT實驗結果發(fā)現(xiàn)各濃度組IL-17均可以促進宮頸腺癌細胞的生長。然而,細胞表現(xiàn)為凈生長的結果與凋亡關系密切,考慮OD值反應的是活細胞的數(shù)量,所以根據(jù)MTT實驗結果,我們篩選出50、100 ng/ml 兩種濃度檢測IL-17對細胞凋亡的影響,結果發(fā)現(xiàn),兩種濃度均可明顯抑制細胞凋亡,并呈劑量依賴,提示IL-17可以促進細胞增殖和抑制細胞凋亡,與國外的多數(shù)研究結果一致。
對于IL-17如何促進腫瘤進展,研究認為,IL-17可以通過上調IL-6的表達促進宮頸癌細胞生長[8]。IL-17也可通過IL-17-MMP7信號軸促進前列腺癌的發(fā)展,并且該信號軸是前列腺上皮內瘤變進展到前列腺癌所必需的[16]。Wang等[17]的研究證實,IL-17可直接刺激腫瘤細胞分泌IL-6,上調促血管生成因子VEGF的表達而促進腫瘤生長。在結腸癌組織中,VEGF及其受體水平升高和微血管密度的變化,與IL-17和IL-17RA(IL-17A的受體)水平升高密切相關,外源性IL-17可以刺激多種結直腸癌細胞株上調VEGF mRNA和蛋白的表達,并呈濃度依賴,表明IL-17可能是通過上調VEGF表達促進腫瘤血管生成進而促進結直腸癌的演進[18,19]。VEGF是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的效果最強的促血管生成因子,在啟動及調節(jié)各種腫瘤新生血管形成過程中起關鍵性作用,該種促血管生成因子的表達水平反映了腫瘤血管內皮細胞增殖、遷移和腫瘤內血管構建的水平,可直接反映腫瘤的生長速度和轉移傾向,故我們選擇觀察VEGF的表達情況,以便更直觀的了解IL-17與宮頸癌細胞增殖的關系。實驗發(fā)現(xiàn),經IL-17刺激48小時后,50 、100 ng/ml兩個濃度組細胞VEGF mRNA和蛋白水平的表達量均增高,以50 ng/ml組作用最為明顯(P< 0.05)。這與文獻報道的IL-17在結腸癌、鼠黑色素瘤等中的研究結果一致。
綜上,IL-17可能通過抑制細胞凋亡、上調VEGF mRNA和蛋白水平的表達的方式,間接促進宮頸腺癌HeLa細胞的體外增殖。我們推測感染高危型HPV的宮頸腺癌,IL-17在其疾病進展中起重要作用,IL-17可能通過抑制腫瘤細胞凋亡及促進腫瘤血管生成的方式促進腫瘤進展。但是IL-17能否作為預測宮頸腺癌進展的良好指標,以及是否可以通過抗IL-17靶向治療宮頸腺癌,還需要大量的基礎及臨床研究。
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EffectofIL-17onproliferationofhumancervicaladenocarcinomacelllineHeLainvitro
DENGKang-li1,GELi-ben2,CHENYu-bing3,YANWen-xing3,WUDa-Jun1
(1.DepartmentofBodyGammaKnifeTreatmentCenter,363Hospital,Chengdu610042,China;2.DepartmentofRadiotherapy,JilinProvincialPeople’sHospital,Changchun130021,China;3.DepartmentofRadiotherapy,TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)
ObjectiveTo explore the effect of IL-17 on proliferation of human cervical adenocarcinoma cell line HeLa in vitro and the underlying mechanisms of the effect.MethodsFirst,human cervical adenocarcinoma cell line HeLa was stimulated with varying concentrations of rIL-17 (0,1,10,50 to 100 ng/ml) for 24 hours.The proliferation rate was detected by a MTT assay.Then,following experiments were carried out according to the selected concentrations of rIL-17.The induced apoptosis cells by starvation were stimulated with rIL-17 (0,50 and 100 ng/ml) for 24 h,the apoptosis was detected by flow cytometry.RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of VEGF at mRNA and protein levels after 48 h of cell stimulation by rIL-17.ResultsAfter stimulation by rIL-17 for a certain period of time,cells proliferation in the 1,10 and 100 ng/ml concentration groups of rIL-17 had no significant changes,but proliferation rate in the 50 ng/ml group was increased significantly (P< 0.01).The late apoptosis rate and total apoptosis rate in 50 ng/ml group were significantly decreased when compared with the normal control group (P< 0.01 and < 0.05,respectively),and the late apoptosis and total apoptosis rate of cells in the 100 ng/ml group were decreased more significantly (allP< 0.01).The production of VEGF mRNA and protein in both the 50 ng/ml and 100 ng/ml,especially in 50 ng/ml group,were increased when compared with the control group (P< 0.05).ConclusionIL-17 could promote the proliferation of cervical adenocarcinoma cell line HeLa in vitro by inhibiting apoptosis and up-regulating the production of VEGF mRNA and protein.
Interleukin-17(IL-17);Cervical neoplasia;Cell proliferation;Vascular endothelial growth factor
R737.33
A
1672-6170(2017)05-0070-04
2016-12-11;
2017-06-23)