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    血清肝素結(jié)合表皮生長因子 mRNA水平與急性冠狀動(dòng)脈綜合征的關(guān)系

    2017-09-03 10:31:24韓鵬黎程曉丹劉建華劉新葉池豪曹巍楊東偉
    中國循環(huán)雜志 2017年8期
    關(guān)鍵詞:逆轉(zhuǎn)錄生長因子肝素

    韓鵬黎,程曉丹,劉建華,劉新葉,池豪,曹巍,楊東偉

    血清肝素結(jié)合表皮生長因子 mRNA水平與急性冠狀動(dòng)脈綜合征的關(guān)系

    韓鵬黎,程曉丹,劉建華,劉新葉,池豪,曹巍,楊東偉

    目的:探討血清中肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)信使核糖核酸(mRNA)水平與急性冠狀動(dòng)脈(冠脈)綜合征的關(guān)系。

    方法:采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測50例急性冠脈綜合征患者(ACS組)及100例正常對照組(NC組)血清中 HB-EGF mRNA的表達(dá)水平,運(yùn)用Logistic回歸分析評估其與急性冠脈綜合征的關(guān)系。

    結(jié)果:與NC組相比,ACS組患者的HB-EGF mRNA水平較高(0.22±0.73 vs 0.46±0.14,P<0.05)。校正高血壓、吸煙、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、體重指數(shù)等單因素分析中有意義的因素后,HB-EGF mRNA水平與急性冠脈綜合征有關(guān)(比值比=5.813,95%可信區(qū)間:2.342~14.426,P<0.001),即HB-EGF mRNA每增加0.1個(gè)灰度值,急性冠脈綜合征風(fēng)險(xiǎn)增加4.813倍。

    結(jié)論:血清中HB-EGF mRNA水平升高與急性冠脈綜合征有關(guān)。

    肝素結(jié)合表皮生長因子;RNA,信使;急性冠狀動(dòng)脈綜合征

    冠心病是一組因冠狀動(dòng)脈(冠脈)粥樣硬化致使血管腔狹窄、阻塞或功能性改變?nèi)绻诿}痙攣導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死而引起的心臟病變,是嚴(yán)重危害人類健康的常見病,其病理改變在本質(zhì)上是動(dòng)脈粥樣硬化。近10年來我國居民冠心病及急性心肌梗死死亡率呈快速上升趨勢。農(nóng)村上升更為明顯[1]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是一個(gè)十分漫長的過程,是內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和炎性反應(yīng)的結(jié)果,但目前動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。急性冠脈綜合征(ACS)是冠心病中較嚴(yán)重的類型,是以冠脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛,繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征,易發(fā)生心力衰竭以及猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。

    近年來,國內(nèi)外相關(guān)研究顯示,肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)作為一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,具有廣泛的生物學(xué)活性。HB-EGF可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞有絲分裂、增殖及遷移,促進(jìn)血管內(nèi)膜增生以及血管重構(gòu)[3]。有研究發(fā)現(xiàn),冠心病患者血清HBEGF較高[4];2010年劉紅旗等[5]發(fā)現(xiàn),在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中,HBEGF 表達(dá)顯著增高。因此,HB-EGF可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析ACS患者血清中HB-EGF 信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)情況,分析HB-EGF mRNA水平與ACS的關(guān)系,以期為ACS分子基因水平上的防治提供新思路和新途徑。

    1 資料與方法

    一般資料:從鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院2015~2016年的住院病例中選取入院診斷考慮ACS并通過冠脈造影(CAG)確診的50例患者作為ACS組,以同期經(jīng)冠脈造影排除冠心病診斷的100 例患者作為正常對照組(NC組)。所有入組病例均排除嚴(yán)重肝腎腦肺疾病、嚴(yán)重瓣膜性心臟病、心肌病、風(fēng)濕性心臟病、肺原性心臟病、重癥感染、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、活動(dòng)性結(jié)核、近1個(gè)月內(nèi)應(yīng)用激素或免疫抑制劑、腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病或感染急性期、銀屑病、妊娠、近期皮膚及組織損傷等疾病。

    試劑:血液RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒、2×Taq MasterMix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、100bp Ladder Marker 試劑盒(上述試劑均購自北京康為世紀(jì)生物公司);PCR 引物及PCR反應(yīng)體系mix由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    ACS診斷:ACS包括ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型ACS, ACS患者診斷參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)2015年《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》[6,7]、2012年《非ST段抬高ACS診斷和治療指南》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

    基本指標(biāo)的測量:身高及體重測量:要求選用同一身高體重計(jì)測量,所有能站立的對象均于入院后第一個(gè)清晨在空腹?fàn)顟B(tài)下,穿單衣單褲、赤腳,腳跟、骶骨部及兩肩胛間緊靠身高計(jì)立柱上;不能站立者采用賽康985型電子病床透析秤測量患者體重,于患者能夠站立時(shí)測量身高。所有數(shù)據(jù)均連續(xù)測兩次取其平均值,計(jì)算體重指數(shù)(BMI)。

    血脂測定:所有患者均于入院后第一個(gè)清晨空腹采取外周靜脈血,測定其甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽膽固醇(LDL-C),所有標(biāo)本使用德國羅氏全自動(dòng)生化儀測定。

    外周血提取 RNA:所有患者均采取外周動(dòng)脈血(用檸檬酸鹽、 乙二胺四乙酸或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品),所取標(biāo)本按購買試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行 RNA 提取,提取過程中保持無菌原則,取 1 μl RNA 經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。并予紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量,要求 OD260/OD280 處于1.8~2.2 之間。

    RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA:提取 RNA 后立即行逆轉(zhuǎn)錄,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行,所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱。

    RT-PCR(表 1):收集所有標(biāo)本后進(jìn)行 RT-PCR。PCR 總反應(yīng)體系為20 μl,其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μl、Mix 10 μl、各基因上下游引物分別 1 μl、無核糖核酸酶水6 μl。PCR 儀型號:德國 biometra T-Gradient。HB-EGF擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min(94℃變性30 s,56℃退火40 s,72℃延伸30 s)循環(huán)34次,72℃延伸7 min,4℃保存;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min(94℃變性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸30 s)循環(huán)34次,72℃延伸7 min,4℃保存。

    PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析:配制1.5% 瓊脂糖凝膠,取 PCR 目的基因產(chǎn)物及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)各 3 μl點(diǎn)樣后進(jìn)行電脈,設(shè)置恒壓為 90 V,約 30 min 后結(jié)束電泳,用凝膠成像分析系統(tǒng)(型號:美國 alpha3400)觀察結(jié)果,拍照后測定 DNA 擴(kuò)增帶光密度值,取目的基因光密度值與相應(yīng)GAPDH光密度值之比作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

    統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料用±s表示,用Logistic回歸分析法評估HB-EGF mRNA水平與ACS的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計(jì)與合成

    2 結(jié)果

    2.1 ACS組和NC組患者的臨床資料比較(表2)

    ACS 組和NC組患者的臨床資料比較,除年齡、性別組成、糖尿病外,高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C、HB-EGF mRNA等指標(biāo)在兩組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表2 ACS組與NC組患者的臨床資料(±s)

    2.2 單因素Logistic回歸分析結(jié)果(表3)

    以是否罹患ACS為應(yīng)變量(1=是,0=否),將HB-EGF mRNA×10、年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙、BMI、TC、TG、LDL-C、高血壓等因素作為自變量(性別:1=男,0=女;高血壓:1=是,2=否;糖尿?。?=是,2=否;吸煙:1=是,2=否),進(jìn)行單因素Logistic回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HB-EGF mRNA水平與ACS有關(guān)[比值比(OR)=4.810,95%可信區(qū)間(CI):3.080~7.514,P<0.001];PCR擴(kuò)增條帶也提示,ACS組患者的HB-EGF mRNA水平高于NC組(圖1)。另外,單因素分析顯示,高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等因素均與ACS有關(guān)。

    2.3 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

    多因素回歸分析校正了高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等在單因素分析中有意義的指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn),HB-EGF mRNA×10仍然與是否罹患ACS有關(guān)(OR=5.813,95%CI:2.342~14.426,P<0.001),即HB-EGF mRNA水平每增加0.1個(gè)灰度值,ACS風(fēng)險(xiǎn)增加4.813倍。

    圖1 ACS組和NC組患者血清HB-EGF信使核糖核酸的表達(dá)情況

    表3 單因素Logistic回歸分析結(jié)果

    3 討論

    HB-EGF 是表皮生長因子家族成員之一,是多種類型細(xì)胞有絲分裂原,亦涉及許多生理和病理過程,包括心臟發(fā)育及心肌修復(fù)、心肌肥大、皮膚傷口愈合、眼瞼形成、腎集合管生成、胚泡著床、肺動(dòng)脈高壓、腫瘤形成等。HB-EGF 在動(dòng)脈粥樣硬化、平滑肌細(xì)胞增生中有重要作用[9]。HB-EGF 與胞膜上表皮生長因子受體(EGFR)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)緊密結(jié)合,通過蛋白激酶 C 和 Ca2+等信號途徑發(fā)揮作用,促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞增生[10]。

    Matsumoto等[4]發(fā)現(xiàn),在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中,HB-EGF在血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表達(dá)顯著提高,促進(jìn)動(dòng)脈硬化,而在非動(dòng)脈粥樣硬化成人動(dòng)脈中,內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞 HB-EGF呈均勻分布,且隨著年齡的增加而緩慢增加。Reape等[11]在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織HB-EGF 的表達(dá)和定位的研究中發(fā)現(xiàn),對比正常和動(dòng)脈粥樣硬化的血管壁,HB-EGF mRNA 只在動(dòng)脈粥樣硬化組織和用其培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá),在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。兩項(xiàng)關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化免疫組化的最新臨床研究均發(fā)現(xiàn),HB-EGF在斑塊局部呈陽性表達(dá),證實(shí) HBEGF 能刺激平滑肌細(xì)胞細(xì)胞的增殖、遷移,從而在動(dòng)脈粥樣硬化形成的過程中發(fā)揮作用[12,13]。

    本研究發(fā)現(xiàn),血清中HB-EGF mRNA水平、高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等因素均與ACS有關(guān),由于本研究旨在分析HB-EGF mRNA水平與ACS的關(guān)系,因此進(jìn)行多因素Logistic回歸分析時(shí)校正了高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等在單因素分析中有意義的指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn),HB-EGF mRNA水平仍然與ACS有關(guān)(OR=5.813,95%CI:2.342~14.426,P<0.001),即HB-EGF mRNA每增加0.1個(gè)灰度值,ACS風(fēng)險(xiǎn)增加4.813倍。HB-EGF mRNA在ACS的發(fā)生和發(fā)展過程中可能作為一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子存在。本文的研究結(jié)果與上述多項(xiàng)研究結(jié)果相符。

    綜上所述,血清中HB-EGF mRNA水平與ACS有關(guān)。

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    Relationship Between Serum mRNA Level of Heparin Binding Epidermal Growth Factor and Acute Coronary Syndrome Occurrence

    HAN Peng-li, CHENG Xiao-dan, LIU Jian-hua, LIU Xin-ye, CHI Hao, CAO Wei, YANG Dong-wei.
    Center of Translational Medicine, Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou (450007), Henan, China

    YANG Dong-wei, Email: yangdongwei@126.com

    Objective: To evaluate the relationship between serum mRNA level of heparin binding epidermal growth factor (HBEGF) and acute coronary syndrome (ACS) occurrence.

    Methods: Our research included in 2 groups: ACS group, n=50 patients and Control group, n=100 normal subjects. Serum HB-EGF mRNA level was examined by RT-PCR and the relationship between HB-EGF mRNA and ACS occurrence was assessed by Logistic regression analysis.

    Results: Compared with Control group, the serum HB-EGF mRNA level of ACS group was higher (0.22±0.73) vs (0.46±0.14), P<0.05. With adjusted meaningful factors of hypertension, smoking, TG, TC, LDL-C, HDL-C and BMI by single factor analysis, multi Logistic regression analysis indicated that serum HB-EGF mRNA was related to ACS occurrence (OR=5.813, 95% CI 2.342-14.426, P<0.001) which meant that upon 0.1 grey value of HB-EGF mRNA elevation, the risk of ACS occurrence may increase 4.813 folds accordingly.

    Conclusion: Serum HB-EGF mRNA level was related to ACS occurrence.

    Heparin binding epidermal growth factor; mRNA; Acute coronary syndrome (Chinese Circulation Journal, 2017,32:748.)

    book=748,ebook=24

    2016-12-04)

    (編輯:朱柳媛)

    河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(142102310460)

    450007 河南省鄭州市,鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心(韓鵬黎、曹巍),心血管內(nèi)科(程曉丹、劉建華、劉新葉、池豪、楊東偉)

    韓鵬黎 藥師 碩士 主要研究方向?yàn)樗幚韺W(xué) Email:hanpengli2013@163.com 通訊作者:楊東偉 Email:yangdongwei@126.com

    R54

    A

    1000-3614(2017)08-0748-04

    10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.005

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