野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1基因缺失對(duì)小鼠心功能的影響

劉可美，劉臣，周鵬，劉娟，譚宇，李健楠，張連峰，張宏冰，顏紅兵

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1基因缺失對(duì)小鼠心功能的影響

劉可美，劉臣，周鵬，劉娟，譚宇，李健楠，張連峰，張宏冰，顏紅兵

目的：探討敲除野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1（Wip1）基因?qū)π∈笮墓δ艿挠绊懠靶呐K組織中基因和蛋白表達(dá)水平的變化。

方法：隨機(jī)選取野生型（WT）小鼠和Wip1基因敲除（Wip1-KO）小鼠各10只，分別檢測(cè)兩組小鼠的心功能和心重/體重比，應(yīng)用蘇木精伊紅（HE）染色觀察小鼠心肌組織的病理形態(tài)，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)心肌組織中心房利鈉肽（ANP）、B型利鈉肽（BNP）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的基因表達(dá)水平，并應(yīng)用蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白包括B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax）和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（c-Caspase3）的表達(dá)水平。

結(jié)果：與WT組小鼠相比，Wip1-KO組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室縮短分?jǐn)?shù)降低（P＜0.05），左心室收縮末期內(nèi)徑增大（P＜0.05）。雖然Wip1-KO組小鼠與WT小鼠的心臟重量沒(méi)有差異，但Wip1-KO組小鼠體重較WT組小鼠減輕（P＜0.05），心重/體重比增加（P＜0.05）。HE染色顯示W(wǎng)ip1-KO組小鼠的心肌形態(tài)與WT組小鼠之間沒(méi)有明顯差異。心肌組織中ANP、BNP、MCP-1和α-SMA基因表達(dá)水平在兩組小鼠之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Wip1-KO組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2和c-Caspase3表達(dá)水平與WT組小鼠之間沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。

結(jié)論：敲除Wip1基因可以損害小鼠心功能，但相關(guān)的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

小鼠，基因敲除；心臟功能試驗(yàn)；細(xì)胞凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:792.)

野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1（wildtype p53-induced phosphatase 1, Wip1）屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶，含有605個(gè)氨基酸，是蛋白磷酸酶2C（Type 2C protein phosphatase，PP2C）家族成員之一[1]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，Wip1在很多疾病和生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其可以通過(guò)某些信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展或調(diào)節(jié)衰老過(guò)程[2]。另外，Wip1在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示，Wip1基因敲除（Wip1 knockout, Wip1-KO）小鼠表現(xiàn)出一系列發(fā)育異常，包括雄鼠體重減輕、生殖器官萎縮，生殖能力下降和生存期縮短[3]。Wip1-KO小鼠免疫功能存在缺陷，體內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量減少，對(duì)炎癥反應(yīng)抵抗能力下降[3]。敲除Wip1基因還可影響小鼠脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，Wip1-KO小鼠主動(dòng)脈中粥樣硬化斑塊明顯減少[4]。Wip1在心臟組織中表達(dá)水平較高[1]，但Wip1基因缺失是否會(huì)影響小鼠心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能鮮有研究。本課題組初步研究發(fā)現(xiàn)，Wip1-KO小鼠心功能減弱。本研究旨在探討Wip1基因敲除對(duì)小鼠心功能的影響并進(jìn)一步明確心臟組織中可能發(fā)生的基因和蛋白水平的改變，為研究Wip1在心臟中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6野生型（wildtype，WT）小鼠購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，Wip1-KO小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供。Wip1-KO小鼠與WT小鼠在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)繁殖，研究用的子代小鼠為8～12周齡雄鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)則。

主要試劑：蘇木精伊紅（hematoxylin and eosin, HE）染色試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。組織RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Realtime PCR，RT-PCR）試劑盒均購(gòu)于日本Takara公司，Nu-PAGE預(yù)制膠Bis-Tris 4%～12%購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光免疫印跡底物購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司。

主要儀器：小動(dòng)物高頻超聲系統(tǒng)Vevo2100購(gòu)自加拿大VisualSonic公司，電子天秤購(gòu)于德國(guó)Satorious公司， PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)于北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 超聲評(píng)估小鼠心功能

Wip1-KO組與WT組分別隨機(jī)抽取10只小鼠，放置于裝有2%異氟烷的密閉箱中麻醉。麻醉好的小鼠左側(cè)臥位平放于檢測(cè)臺(tái)，使用Vevo 2100高頻小動(dòng)物超聲檢測(cè)系統(tǒng)行心臟超聲檢查，選用M型超聲模式，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at endsystolic, LVIDs）并計(jì)算小鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening, LVFS）。

1.3 小鼠體重、心臟重量測(cè)量

用電子天秤準(zhǔn)確稱(chēng)量每只小鼠體重。小鼠麻醉處死后，迅速取出心臟置于冰浴的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，擠出心腔內(nèi)殘余血液，用剪刀除去心臟大血管起始部，用濾紙吸干心臟表面液體。于分析天平上稱(chēng)量心臟并記錄重量。根據(jù)小鼠體重和心臟重量計(jì)算心重/體重比。

1.4 HE染色觀察小鼠心肌組織的病理形態(tài)

小鼠心臟稱(chēng)重后于多聚甲醛溶液中固定，脫水，行石蠟切片，用HE染色試劑盒染色。電鏡下觀察染色結(jié)果并拍照記錄。

1.5 檢測(cè)小鼠心肌組織中基因表達(dá)水平

取適量小鼠心肌組織，用組織RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RT-PCR試劑盒檢測(cè)Wip1、心房利鈉肽（atrial natriureticpeptide，ANP）、B型利鈉肽（B-type Natriuretic Peptide，BNP）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)基因表達(dá)水平。所有引物均由上海Invitrogen公司合成，引物序列如表1所示，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因。

表1 所用引物序列

1.6 檢測(cè)小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取適量心肌組織提取總蛋白。各取等量樣品上樣，先在80 V電壓下電泳30 min，待樣品進(jìn)入分離膠后用100 V電壓電泳1.5 h。通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取下PVDF膜，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，分別加入一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2，1：1000，貨號(hào)CST2876，Cell Signaling Technology公司,美國(guó)）、一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax，1:1000，貨號(hào)SC493，Santa Cruz公司，美國(guó)）、一抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（c-Caspase3，1:1000, 貨號(hào)CST9664, Cell Signaling Technology公司，美國(guó))和內(nèi)參GAPDH（1:4000，貨號(hào)CW0100M，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)），4℃孵育過(guò)夜。用PBST液洗膜3次，每次10 min，加入與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗孵育2 h，用PBST液洗膜3次，每次10 min，ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH的灰度值比值反映蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)水平、心功能指標(biāo)比較：與WT組小鼠相比，Wip1-KO組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)水平明顯降低（圖1）。應(yīng)用超聲系統(tǒng)對(duì)兩組小鼠心功能進(jìn)行評(píng)估的結(jié)果顯示（圖2），Wip1-KO組小鼠的LVEF和LVFS均低于WT組小鼠（P＜0.05），LVIDs比WT組小鼠高（P＜0.05）。雖然Wip1-KO組小鼠的LVIDd比WT組小鼠稍高，但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

兩組小鼠的體重、心臟重量及心重/體重比的比較（表2）： 通過(guò)測(cè)量小鼠體重和心臟重量評(píng)估小鼠心臟大小。與同齡WT組小鼠相比，Wip1-KO組小鼠的體重減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。雖然兩組小鼠的心臟重量無(wú)明顯差異（P＞0.05），但心重/體重比在Wip1-KO小鼠中明顯增加（P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)比較

圖2 兩組小鼠的心功能指標(biāo)的比較

表2 兩組小鼠的體重、心臟重量及心重/體重比的比較

兩組小鼠心肌病理形態(tài)比較（圖3）：兩組小鼠心肌組織切片行HE染色顯示，Wip1-KO組小鼠的心肌組織病理形態(tài)基本正常，與WT小鼠心肌組織無(wú)明顯差異。

圖3 兩組小鼠心肌組織病理形態(tài)比較（×100）

兩組小鼠心臟中ANP、BNP、MCP-1和α-SMA基因表達(dá)：受到外界病理因素刺激或應(yīng)激時(shí)，心肌組織中某些基因表達(dá)上調(diào)，可以反映心肌組織受損。我們檢測(cè)了兩組小鼠的ANP、BNP、MCP-1和α-SMA的表達(dá)水平（圖4）。與WT組小鼠相比，Wip1-KO組小鼠心肌組織中ANP、BNP和α-SMA mRNA的表達(dá)都略有減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Wip1-KO組小鼠心肌組織MCP-1 mRNA基因表達(dá)較WT組小鼠升高，但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 兩組小鼠心肌組織ANP、BNP、MCP-1和α-SMA的mRNA表達(dá)水平比較

兩組小鼠心臟中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（圖5）：通過(guò)Western blot對(duì)小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，Wip1-KO組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值和c-Caspase3的表達(dá)與WT組小鼠之間沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。

圖5 兩組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

Wip1在很多病理和生理過(guò)程中起著重要作用。研究報(bào)道，Wip1基因敲除可影響小鼠血糖代謝。敲除Wip1基因的小鼠在高脂飲食時(shí)出現(xiàn)糖耐量異常和胰島素抵抗[5]。Wip1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)化影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，并通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路和自噬影響斑塊進(jìn)展[4]。本研究中敲除Wip1基因的小鼠心功能下降，心重/體重比增加，初步提示W(wǎng)ip1在小鼠心臟中也起著調(diào)節(jié)作用。

Wip1基因缺失小鼠存在發(fā)育缺陷。與野生型小鼠相比，敲除Wip1基因的雄性小鼠體重減輕，皮膚表面容易出現(xiàn)潰瘍，生精小管退化，脾臟增大，伴或不伴有正常的脾臟結(jié)構(gòu)缺失，并且對(duì)抗原的敏感性增加[3]。敲除Wip1基因可以影響小鼠胸腺發(fā)育，胸腺中T細(xì)胞數(shù)量較少并且發(fā)育異常[6]。此外，Wip1基因缺失也可以影響小鼠體內(nèi)B細(xì)胞發(fā)育，骨髓、外周血液和脾臟中B細(xì)胞數(shù)量明顯減少，早期B細(xì)胞前體出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)在缺陷[7]。與既往研究結(jié)果相一致，本研究發(fā)現(xiàn)Wip1-KO小鼠的體重比野生型小鼠減輕。雖然兩組小鼠之間心臟重量的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Wip1-KO小鼠的心重/體重比值較野生型小鼠大。本研究還發(fā)現(xiàn)敲除Wip1基因可引起小鼠心功能減弱，射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)都降低，左心室收縮末期內(nèi)徑增大，說(shuō)明Wip1基因缺失可以損害小鼠心功能。

ANP和BNP是心臟分泌的利鈉肽，心臟壓力超負(fù)荷或容量超負(fù)荷時(shí)分泌增加。因此，ANP和BNP基因表達(dá)水平上調(diào)可以反映心臟收縮或舒張功能受損[8]。MCP-1是單核細(xì)胞趨化因子，具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。MCP-1可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移直接影響損傷部位血管生成[9]，并通過(guò)刺激細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)纖維組織形成[10]。小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，MCP-1可以誘導(dǎo)炎性單核細(xì)胞聚集，促進(jìn)內(nèi)膜增生，從而使梗死面積擴(kuò)大并加重心肌損傷[11,12]。α-SMA主要由血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)，在發(fā)育過(guò)程中被α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白和α-心肌肌動(dòng)蛋白取代。病理性刺激或應(yīng)激狀態(tài)可誘導(dǎo)α-SMA表達(dá)，心肌梗死后疤痕組織中成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA水平上調(diào)[13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，α-SMA可與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的收縮功能[14]。本研究檢測(cè)了這四種基因在小鼠心肌組織中的表達(dá)水平，雖然兩組小鼠之間存在一定差異，但差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)濃縮和核DNA降解[15]。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有大約25種蛋白。其中，Bcl-2具有抗凋亡作用，Bax屬于促凋亡蛋白[16]。Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶，在凋亡過(guò)程中主要作用是清除細(xì)胞蛋白，引起細(xì)胞的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)改變。受到凋亡信號(hào)刺激后，Bcl-2家族的促凋亡成員如Bax活化，進(jìn)而引起線(xiàn)粒體膜上的滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔形成。線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C等形成凋亡體，活化Caspase 9和Caspase 3，從而誘發(fā)凋亡[17]。p53在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)Wip1可通過(guò)使p53去磷酸化和使上游蛋白失活達(dá)到抑制凋亡的作用[18]。本研究檢測(cè)了WT小鼠和Wip1-KO小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，兩組小鼠之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示W(wǎng)ip1敲除不影響心肌組織中凋亡信號(hào)通路。

本研究發(fā)現(xiàn)敲除Wip1基因可影響小鼠心功能，但具體的分子學(xué)機(jī)制尚不清楚，是此研究的局限之一。此外，研究中缺乏Wip1基因敲除小鼠補(bǔ)充外源性Wip1蛋白對(duì)照組，是該研究的另一不足。

雖然本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wip1基因缺失可損害小鼠心功能和影響小鼠心重/體重比，但并不影響小鼠心肌組織病理形態(tài)改變,也不影響心臟中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。Wip1基因敲除通過(guò)何種信號(hào)通路影響小鼠心功能仍需進(jìn)一步研究。

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（編輯:許菁）

Impact of Wildtype p53 Induced Phosphatase 1 Gene Lacking on Heart Function in Experimental Mice

LIU Ke-mei, LIU Chen, ZHOU Peng, LIU Juan, TAN Yu, LI Jian-nan, ZHANG Lian-feng, ZHANG Hong-bing, YAN Hong-bing.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

YAN Hong-bing, Email: hbyanfuwai@aliyun.com

Objective: To explore the impact of knocking out wildtype p53 phosphatase 1 gene on heart function with the changes of cardiac tissue mRNA and protein expressions in experimental mice.

Methods: Our research included in 2 groups: Wildtype (WT) mice group and Wip1 knockout (Wip1-KO) mice group. n=10 in each group. The heart function, ratio of heart weight to body weight (HW/BW) were examined and compared between 2 groups; cardiac tissue morphology was observed by HE staining; mRNA expressions of ANP, BNP, MCP-1 and α-SMA were determined by RT-PCR and protein expressions of Bcl-2, Bax and c-caspase3 were measured by Western blot analysis.

Results: Compared with WT mice group, Wip1-KO mice group showed decreased Wip1 mRNA expression, P＜0.05, decreased LVEF, LV fraction shortening and increased left ventricular end systolic diameter (LVESD), all P＜0.05; Wip1-KO mice group had reduced BW and elevated ratio of HW/BW, both P＜0.05 even the heart weight was similar between 2 groups. There was no difference in cardiac tissue morphology between 2 groups; mRNA expressions of ANP, BNP, MCP-1 and α-SMA

Conclusion: Wip1 gene knockout may impair the heart function in experimental mice, while the relevant mechanism should be further investigated.

Mice, Gene knockout; Heart function test; Apoptosis

book=792,ebook=68

國(guó)家自然科學(xué)基金（81270288 ， 81541095）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外醫(yī)院（劉可美、劉臣、周鵬、劉娟、譚宇、李健楠、顏紅兵）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心（張連峰）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院（張宏冰）

劉可美 碩士研究生 主要從事心血管病學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究 Email：liukemei@aliyun.com 通訊作者：顏紅兵 Email: hbyanfuwai@aliyun.com

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A

1000-3614（2017）08-0792-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.015were similar between 2 groups, P＞0.05; apoptosis related protein expressions of Bax/Bcl-2 and c-caspase3 were similar between 2 groups, P＞0.05.

2017-02-19）