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    野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1基因缺失對(duì)小鼠心功能的影響

    2017-09-03 10:31:24劉可美劉臣周鵬劉娟譚宇李健楠張連峰張宏冰顏紅兵
    中國(guó)循環(huán)雜志 2017年8期
    關(guān)鍵詞:體重心功能心肌

    劉可美,劉臣,周鵬,劉娟,譚宇,李健楠,張連峰,張宏冰,顏紅兵

    基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

    野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1基因缺失對(duì)小鼠心功能的影響

    劉可美,劉臣,周鵬,劉娟,譚宇,李健楠,張連峰,張宏冰,顏紅兵

    目的:探討敲除野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1(Wip1)基因?qū)π∈笮墓δ艿挠绊懠靶呐K組織中基因和蛋白表達(dá)水平的變化。

    方法:隨機(jī)選取野生型(WT)小鼠和Wip1基因敲除(Wip1-KO)小鼠各10只,分別檢測(cè)兩組小鼠的心功能和心重/體重比,應(yīng)用蘇木精伊紅(HE)染色觀察小鼠心肌組織的病理形態(tài),應(yīng)用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)心肌組織中心房利鈉肽(ANP)、B型利鈉肽(BNP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的基因表達(dá)水平,并應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白包括B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(c-Caspase3)的表達(dá)水平。

    結(jié)果:與WT組小鼠相比,Wip1-KO組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05),左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室縮短分?jǐn)?shù)降低(P<0.05),左心室收縮末期內(nèi)徑增大(P<0.05)。雖然Wip1-KO組小鼠與WT小鼠的心臟重量沒(méi)有差異,但Wip1-KO組小鼠體重較WT組小鼠減輕(P<0.05),心重/體重比增加(P<0.05)。HE染色顯示W(wǎng)ip1-KO組小鼠的心肌形態(tài)與WT組小鼠之間沒(méi)有明顯差異。心肌組織中ANP、BNP、MCP-1和α-SMA基因表達(dá)水平在兩組小鼠之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Wip1-KO組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2和c-Caspase3表達(dá)水平與WT組小鼠之間沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

    結(jié)論:敲除Wip1基因可以損害小鼠心功能,但相關(guān)的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

    小鼠,基因敲除;心臟功能試驗(yàn);細(xì)胞凋亡

    (Chinese Circulation Journal, 2017,32:792.)

    野生型p53誘導(dǎo)的磷酸酶1(wildtype p53-induced phosphatase 1, Wip1)屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶,含有605個(gè)氨基酸,是蛋白磷酸酶2C(Type 2C protein phosphatase,PP2C)家族成員之一[1]。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn),Wip1在很多疾病和生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,其可以通過(guò)某些信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展或調(diào)節(jié)衰老過(guò)程[2]。另外,Wip1在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示,Wip1基因敲除(Wip1 knockout, Wip1-KO)小鼠表現(xiàn)出一系列發(fā)育異常,包括雄鼠體重減輕、生殖器官萎縮,生殖能力下降和生存期縮短[3]。Wip1-KO小鼠免疫功能存在缺陷,體內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量減少,對(duì)炎癥反應(yīng)抵抗能力下降[3]。敲除Wip1基因還可影響小鼠脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,Wip1-KO小鼠主動(dòng)脈中粥樣硬化斑塊明顯減少[4]。Wip1在心臟組織中表達(dá)水平較高[1],但Wip1基因缺失是否會(huì)影響小鼠心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能鮮有研究。本課題組初步研究發(fā)現(xiàn),Wip1-KO小鼠心功能減弱。本研究旨在探討Wip1基因敲除對(duì)小鼠心功能的影響并進(jìn)一步明確心臟組織中可能發(fā)生的基因和蛋白水平的改變,為研究Wip1在心臟中的作用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BL/6野生型(wildtype,WT)小鼠購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,Wip1-KO小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供。Wip1-KO小鼠與WT小鼠在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)繁殖,研究用的子代小鼠為8~12周齡雄鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)則。

    主要試劑:蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。組織RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Realtime PCR,RT-PCR)試劑盒均購(gòu)于日本Takara公司,Nu-PAGE預(yù)制膠Bis-Tris 4%~12%購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光免疫印跡底物購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司。

    主要儀器:小動(dòng)物高頻超聲系統(tǒng)Vevo2100購(gòu)自加拿大VisualSonic公司,電子天秤購(gòu)于德國(guó)Satorious公司, PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)于北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

    1.2 超聲評(píng)估小鼠心功能

    Wip1-KO組與WT組分別隨機(jī)抽取10只小鼠,放置于裝有2%異氟烷的密閉箱中麻醉。麻醉好的小鼠左側(cè)臥位平放于檢測(cè)臺(tái),使用Vevo 2100高頻小動(dòng)物超聲檢測(cè)系統(tǒng)行心臟超聲檢查,選用M型超聲模式,測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)和左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at endsystolic, LVIDs)并計(jì)算小鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening, LVFS)。

    1.3 小鼠體重、心臟重量測(cè)量

    用電子天秤準(zhǔn)確稱(chēng)量每只小鼠體重。小鼠麻醉處死后,迅速取出心臟置于冰浴的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,擠出心腔內(nèi)殘余血液,用剪刀除去心臟大血管起始部,用濾紙吸干心臟表面液體。于分析天平上稱(chēng)量心臟并記錄重量。根據(jù)小鼠體重和心臟重量計(jì)算心重/體重比。

    1.4 HE染色觀察小鼠心肌組織的病理形態(tài)

    小鼠心臟稱(chēng)重后于多聚甲醛溶液中固定,脫水,行石蠟切片,用HE染色試劑盒染色。電鏡下觀察染色結(jié)果并拍照記錄。

    1.5 檢測(cè)小鼠心肌組織中基因表達(dá)水平

    取適量小鼠心肌組織,用組織RNA提取試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RT-PCR試劑盒檢測(cè)Wip1、心房利鈉肽(atrial natriureticpeptide,ANP)、B型利鈉肽(B-type Natriuretic Peptide,BNP)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)基因表達(dá)水平。所有引物均由上海Invitrogen公司合成,引物序列如表1所示,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因。

    表1 所用引物序列

    1.6 檢測(cè)小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

    取適量心肌組織提取總蛋白。各取等量樣品上樣,先在80 V電壓下電泳30 min,待樣品進(jìn)入分離膠后用100 V電壓電泳1.5 h。通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取下PVDF膜,置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,分別加入一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2,1:1000,貨號(hào)CST2876,Cell Signaling Technology公司,美國(guó))、一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax,1:1000,貨號(hào)SC493,Santa Cruz公司,美國(guó))、一抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(c-Caspase3,1:1000, 貨號(hào)CST9664, Cell Signaling Technology公司,美國(guó))和內(nèi)參GAPDH(1:4000,貨號(hào)CW0100M,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,中國(guó)),4℃孵育過(guò)夜。用PBST液洗膜3次,每次10 min,加入與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗孵育2 h,用PBST液洗膜3次,每次10 min,ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值,以目的條帶與GAPDH的灰度值比值反映蛋白表達(dá)水平。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    兩組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)水平、心功能指標(biāo)比較:與WT組小鼠相比,Wip1-KO組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(圖1)。應(yīng)用超聲系統(tǒng)對(duì)兩組小鼠心功能進(jìn)行評(píng)估的結(jié)果顯示(圖2),Wip1-KO組小鼠的LVEF和LVFS均低于WT組小鼠(P<0.05),LVIDs比WT組小鼠高(P<0.05)。雖然Wip1-KO組小鼠的LVIDd比WT組小鼠稍高,但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    兩組小鼠的體重、心臟重量及心重/體重比的比較(表2): 通過(guò)測(cè)量小鼠體重和心臟重量評(píng)估小鼠心臟大小。與同齡WT組小鼠相比,Wip1-KO組小鼠的體重減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然兩組小鼠的心臟重量無(wú)明顯差異(P>0.05),但心重/體重比在Wip1-KO小鼠中明顯增加(P<0.05)。

    圖1 兩組小鼠心肌組織中Wip1 mRNA表達(dá)比較

    圖2 兩組小鼠的心功能指標(biāo)的比較

    表2 兩組小鼠的體重、心臟重量及心重/體重比的比較

    兩組小鼠心肌病理形態(tài)比較(圖3):兩組小鼠心肌組織切片行HE染色顯示,Wip1-KO組小鼠的心肌組織病理形態(tài)基本正常,與WT小鼠心肌組織無(wú)明顯差異。

    圖3 兩組小鼠心肌組織病理形態(tài)比較(×100)

    兩組小鼠心臟中ANP、BNP、MCP-1和α-SMA基因表達(dá):受到外界病理因素刺激或應(yīng)激時(shí),心肌組織中某些基因表達(dá)上調(diào),可以反映心肌組織受損。我們檢測(cè)了兩組小鼠的ANP、BNP、MCP-1和α-SMA的表達(dá)水平(圖4)。與WT組小鼠相比,Wip1-KO組小鼠心肌組織中ANP、BNP和α-SMA mRNA的表達(dá)都略有減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Wip1-KO組小鼠心肌組織MCP-1 mRNA基因表達(dá)較WT組小鼠升高,但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖4 兩組小鼠心肌組織ANP、BNP、MCP-1和α-SMA的mRNA表達(dá)水平比較

    兩組小鼠心臟中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(圖5):通過(guò)Western blot對(duì)小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),Wip1-KO組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值和c-Caspase3的表達(dá)與WT組小鼠之間沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

    圖5 兩組小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

    3 討論

    Wip1在很多病理和生理過(guò)程中起著重要作用。研究報(bào)道,Wip1基因敲除可影響小鼠血糖代謝。敲除Wip1基因的小鼠在高脂飲食時(shí)出現(xiàn)糖耐量異常和胰島素抵抗[5]。Wip1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)化影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,并通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路和自噬影響斑塊進(jìn)展[4]。本研究中敲除Wip1基因的小鼠心功能下降,心重/體重比增加,初步提示W(wǎng)ip1在小鼠心臟中也起著調(diào)節(jié)作用。

    Wip1基因缺失小鼠存在發(fā)育缺陷。與野生型小鼠相比,敲除Wip1基因的雄性小鼠體重減輕,皮膚表面容易出現(xiàn)潰瘍,生精小管退化,脾臟增大,伴或不伴有正常的脾臟結(jié)構(gòu)缺失,并且對(duì)抗原的敏感性增加[3]。敲除Wip1基因可以影響小鼠胸腺發(fā)育,胸腺中T細(xì)胞數(shù)量較少并且發(fā)育異常[6]。此外,Wip1基因缺失也可以影響小鼠體內(nèi)B細(xì)胞發(fā)育,骨髓、外周血液和脾臟中B細(xì)胞數(shù)量明顯減少,早期B細(xì)胞前體出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)在缺陷[7]。與既往研究結(jié)果相一致,本研究發(fā)現(xiàn)Wip1-KO小鼠的體重比野生型小鼠減輕。雖然兩組小鼠之間心臟重量的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但Wip1-KO小鼠的心重/體重比值較野生型小鼠大。本研究還發(fā)現(xiàn)敲除Wip1基因可引起小鼠心功能減弱,射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)都降低,左心室收縮末期內(nèi)徑增大,說(shuō)明Wip1基因缺失可以損害小鼠心功能。

    ANP和BNP是心臟分泌的利鈉肽,心臟壓力超負(fù)荷或容量超負(fù)荷時(shí)分泌增加。因此,ANP和BNP基因表達(dá)水平上調(diào)可以反映心臟收縮或舒張功能受損[8]。MCP-1是單核細(xì)胞趨化因子,具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。MCP-1可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移直接影響損傷部位血管生成[9],并通過(guò)刺激細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)纖維組織形成[10]。小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中,MCP-1可以誘導(dǎo)炎性單核細(xì)胞聚集,促進(jìn)內(nèi)膜增生,從而使梗死面積擴(kuò)大并加重心肌損傷[11,12]。α-SMA主要由血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá),在發(fā)育過(guò)程中被α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白和α-心肌肌動(dòng)蛋白取代。病理性刺激或應(yīng)激狀態(tài)可誘導(dǎo)α-SMA表達(dá),心肌梗死后疤痕組織中成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA水平上調(diào)[13]。近期研究發(fā)現(xiàn),α-SMA可與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的收縮功能[14]。本研究檢測(cè)了這四種基因在小鼠心肌組織中的表達(dá)水平,雖然兩組小鼠之間存在一定差異,但差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡,主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小,染色質(zhì)濃縮和核DNA降解[15]。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起著重要作用,迄今為止,已發(fā)現(xiàn)有大約25種蛋白。其中,Bcl-2具有抗凋亡作用,Bax屬于促凋亡蛋白[16]。Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶,在凋亡過(guò)程中主要作用是清除細(xì)胞蛋白,引起細(xì)胞的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)改變。受到凋亡信號(hào)刺激后,Bcl-2家族的促凋亡成員如Bax活化,進(jìn)而引起線(xiàn)粒體膜上的滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔形成。線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C等形成凋亡體,活化Caspase 9和Caspase 3,從而誘發(fā)凋亡[17]。p53在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,研究發(fā)現(xiàn)Wip1可通過(guò)使p53去磷酸化和使上游蛋白失活達(dá)到抑制凋亡的作用[18]。本研究檢測(cè)了WT小鼠和Wip1-KO小鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,兩組小鼠之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示W(wǎng)ip1敲除不影響心肌組織中凋亡信號(hào)通路。

    本研究發(fā)現(xiàn)敲除Wip1基因可影響小鼠心功能,但具體的分子學(xué)機(jī)制尚不清楚,是此研究的局限之一。此外,研究中缺乏Wip1基因敲除小鼠補(bǔ)充外源性Wip1蛋白對(duì)照組,是該研究的另一不足。

    雖然本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wip1基因缺失可損害小鼠心功能和影響小鼠心重/體重比,但并不影響小鼠心肌組織病理形態(tài)改變,也不影響心臟中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。Wip1基因敲除通過(guò)何種信號(hào)通路影響小鼠心功能仍需進(jìn)一步研究。

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    (編輯:許菁)

    Impact of Wildtype p53 Induced Phosphatase 1 Gene Lacking on Heart Function in Experimental Mice

    LIU Ke-mei, LIU Chen, ZHOU Peng, LIU Juan, TAN Yu, LI Jian-nan, ZHANG Lian-feng, ZHANG Hong-bing, YAN Hong-bing.
    State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

    YAN Hong-bing, Email: hbyanfuwai@aliyun.com

    Objective: To explore the impact of knocking out wildtype p53 phosphatase 1 gene on heart function with the changes of cardiac tissue mRNA and protein expressions in experimental mice.

    Methods: Our research included in 2 groups: Wildtype (WT) mice group and Wip1 knockout (Wip1-KO) mice group. n=10 in each group. The heart function, ratio of heart weight to body weight (HW/BW) were examined and compared between 2 groups; cardiac tissue morphology was observed by HE staining; mRNA expressions of ANP, BNP, MCP-1 and α-SMA were determined by RT-PCR and protein expressions of Bcl-2, Bax and c-caspase3 were measured by Western blot analysis.

    Results: Compared with WT mice group, Wip1-KO mice group showed decreased Wip1 mRNA expression, P<0.05, decreased LVEF, LV fraction shortening and increased left ventricular end systolic diameter (LVESD), all P<0.05; Wip1-KO mice group had reduced BW and elevated ratio of HW/BW, both P<0.05 even the heart weight was similar between 2 groups. There was no difference in cardiac tissue morphology between 2 groups; mRNA expressions of ANP, BNP, MCP-1 and α-SMA

    Conclusion: Wip1 gene knockout may impair the heart function in experimental mice, while the relevant mechanism should be further investigated.

    Mice, Gene knockout; Heart function test; Apoptosis

    book=792,ebook=68

    國(guó)家自然科學(xué)基金(81270288 , 81541095)

    100037 北京市,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外醫(yī)院(劉可美、劉臣、周鵬、劉娟、譚宇、李健楠、顏紅兵);中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心(張連峰);中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院(張宏冰)

    劉可美 碩士研究生 主要從事心血管病學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究 Email:liukemei@aliyun.com 通訊作者:顏紅兵 Email: hbyanfuwai@aliyun.com

    R54

    A

    1000-3614(2017)08-0792-05

    10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.015were similar between 2 groups, P>0.05; apoptosis related protein expressions of Bax/Bcl-2 and c-caspase3 were similar between 2 groups, P>0.05.

    2017-02-19)

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