TERT修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)TBI大鼠自噬及認(rèn)知功能的作用及機(jī)制

楊烽

[摘要]目的 研究端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）促進(jìn)腦創(chuàng)傷（TBI）大鼠腦組織自噬及認(rèn)知功能的作用，探討可能的分子機(jī)制。方法 分離并鑒定大鼠BMSCs，應(yīng)用pLXSN-TERT病毒重組子轉(zhuǎn)染BMSCs。應(yīng)用Marmarou方法制備腦創(chuàng)傷TBI大鼠模型。將64只大鼠隨機(jī)分為四組，分別為TBI組、BMSCs-TBI組和TERT-BMSCs-TBI組和對照組，每組各16只。應(yīng)用HE染色光鏡觀察大鼠腦組織結(jié)構(gòu)及病理改變。Western blot檢測BDNF、NGF等神經(jīng)生長因子的蛋白表達(dá)水平；檢測自噬相關(guān)因子Beclin1和Parkin的蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用Morris水迷宮方法檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能的改變。結(jié)果 在Morris水迷宮檢測大鼠定位航行試驗(yàn)中，與對照組比較，TBI組平均逃避潛伏期延長（P<0.05）；與TBI組比較，TERT-BMSCs-TBI組、BMSCs-TBI組平均逃避潛伏期縮短（P<0.05）。在空間探索試驗(yàn)中，TBI組大鼠在原平臺象限的停留時(shí)間明顯較對照組大鼠縮短；而TERT-BMSCs-TBI組、BMSCs-TBI組與TBI組比較，在原平臺象限的停留時(shí)間明顯延長（P<0.05）。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與TBI組比較，BMSCs-TBI組、TERT-BMSCs-TBI組腦皮層組織中BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05）；與BMSCs-TBI組比較，TERT-BMSCs-TBI組顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 TERT修飾的BMSCs較普通BMSCs移植TBI大鼠學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能恢復(fù)更顯著，其分子機(jī)制可能與增強(qiáng)自噬功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腦創(chuàng)傷；端粒酶；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；自噬；認(rèn)知功能

[中圖分類號] R651.15 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（c）-0104-04

Effects and mechanisms of TERT modified bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on autophagy and cognitive function in TBI rats

YANG Feng

Department of Neurosurgery，the Sixth People′s Hospital of Chongqing，Chongqing 400060，China

[Abstract]Objective To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） under modification of telomerase reverse transcriptase （TERT） gene in improving brain tissue autophagy and cognitive function of rats with traumatic brain injury （TBI），as well as to investigate possible molecular mechanisms.Methods BMCSs of rats was separated and authenticated，pLXSN-TERT virus recombinants were applied to carry out transfection of BMSCs，Marmarou method was adopted to prepare the models of rats with TBI. 64 rats were randomly divided into four groups，namely TBI group，BMSCs-TBI group，TERT-BMSCs-TBI group and the control group，with 16 rats in each group.HE light microscopy was used to observe the brain tissue structure of rats and pathologic change.The protein expression levels of BDNF，NGF and other nerve growth factors were detected with Western blot；as well as the protein expression levels of Beclin1 and Parkin relevant to autophagy were detected correspondingly.Then Morris （Morris Water Maze） was applied to detect the change on learning and memorizing cognitive function of rats.Results Among Morris detecting place navigation test of rats，the mean escape latency of TBI group prolongs compared to the control group （P<0.05）.Compared to TBI group，the TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group take less mean escape latency （P<0.05）.In the space probe trial，the duration of stay of TBI group in original platform quadrant was obviously less than the control group；the duration of stay of TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group significantly prolong compared to TBI group （P<0.05）.Through Western blot detection，the result indicated that expression of protein of BDNF，NGF，Beclin1，Parkin in brain mantle tissue increased obviously in TERT-BMSCs-TBI group and BMSCs-TBI group compared to TBI group （P<0.05），and significantly increased in group TERT-BMSCs-TBI compared with BMSCs-TBI group （P<0.05）.Conclusion Compared to general BMSCs transplant，the rats with BMSCs under modification of TERT have more significant learning and memorizing cognitive recovery function，that the molecular mechanism may be related to autophagy function enhancement.

[Key words]Traumatic brain injury；Telomerase；Bone marrow mesenchymal stem cells；Autophagy；Cognitive function

腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科較為常見的一種多發(fā)病，死亡率和傷殘率居嚴(yán)重創(chuàng)傷之首[1]。降低TBI的死亡率、致殘率以及提高患者的預(yù)后一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干細(xì)胞的一種，可誘導(dǎo)內(nèi)源性干細(xì)胞增殖，促進(jìn)腦組織再生以及神經(jīng)功能恢復(fù)[3-4]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)極為有效的清除機(jī)制，中樞及外周組織內(nèi)細(xì)胞自噬可以增加細(xì)胞代謝水平，有助于代謝廢物的清除，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量的相對穩(wěn)定[5-6]。本研究應(yīng)用Marmarou方法制備TBI大鼠模型，應(yīng)用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到腦創(chuàng)傷大鼠后，觀察BDNF、NGF、自噬相關(guān)因子Beclin1和Parkin的蛋白表達(dá)水平，應(yīng)用Morris水迷宮方法檢測TBI大鼠學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能，探討端粒酶增加的BMSCs對TBI大鼠的恢復(fù)治療作用與自噬功能的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象與儀器

1.1.1 BMSCs 孵育條件：無菌；混合細(xì)胞取得方法：L-DMEM培養(yǎng)基（北京天根生化有限公司）（含10% FBS）反復(fù)沖洗大鼠股骨、脛骨骨髓腔取得混合細(xì)胞。換液頻率：每3天換1次。傳代比率為1∶2。傳代條件：細(xì)胞融合率為85%。

1.1.2 TERT修飾BMSCs及細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體重組子pLXSN-TERT[7]。應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（北京沃比森科技有限公司）轉(zhuǎn)染重組子pLXSN-TERT至BMSCs，用G418于48 h后篩選TERT-BMSCs繼續(xù)培養(yǎng)，2個(gè)月后檢測TERT mRNA的表達(dá)和端粒酶活性，取對數(shù)生長期細(xì)胞與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合后接種，孵育4～6周后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆個(gè)數(shù)。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞為陽性對照。

1.1.3動物模型 將64只健康的雄性Wistar大鼠（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室）作為動物模型對象，隨機(jī)分為TBI組、BMSCs-TBI組、TERT-BMSCs-TBI組和對照組，每組各16只，四組大鼠每只體重約400 g。應(yīng)用Marmarou方法制備TBI大鼠模型（具體方法：用重量450 g、直徑18 mm的銅棒，垂直從1.2 m自由下落，撞擊在大鼠冠狀縫與矢狀縫正中鋼墊上，造成大鼠中度彌漫性TBI）。造模成功后24 h分別經(jīng)鼠尾靜脈注射移植1 ml體積的PBS、BMSCs（3×106/ml）、TERT-BMSCs（3×106/ml）。移植后7～9 d統(tǒng)計(jì)大鼠的存活量，然后將這些大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.2檢測方法

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)分析裝置購自上海欣軟信息科技有限公司，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，前者是記錄逃避潛伏期，后者是記錄在原平臺象限游泳時(shí)間[8]。大鼠經(jīng)水迷宮測試后行心臟灌注4%多聚甲醛（上海翊圣生物科技有限公司）取腦，繼續(xù)置入4%多聚甲醛中固定，在乳頭體和視交叉處垂直切斷腦組織，常規(guī)酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片。HE染色，封固。光鏡下觀察并拍片。

1.2.2大鼠腦皮層組織Western blot蛋白印跡法檢測BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表達(dá)水平 大鼠經(jīng)水迷宮測試后斷頭處死，取腦，分離腦皮層組織，猝冷，取50 mg腦皮層組織，裂解、離心、取上清液，Bradford法測定蛋白濃度，上樣、變性，取樣品50 μg行蛋白電泳，將蛋白印記轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4℃過夜，洗膜后加入二抗，孵育，膜清洗后顯色、顯影?；叶葤呙琛?/p>

1.3評估指標(biāo)

BMSCs表面標(biāo)志物的鑒定；BMSCs轉(zhuǎn)染TERT后端粒酶活性的鑒定：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測；大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試結(jié)果；大鼠腦皮層HE染色、光鏡下觀察結(jié)果；大鼠腦皮層組織BDNF、NGF、Beclin1、Parkin蛋白表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student′s t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 BMSCs表面標(biāo)志物的鑒定

CD90、CD44和CD29標(biāo)記陽性，CD45、CD34和CD31標(biāo)記陰性。

2.2細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

BMSCs-TBI組、TERT-BMSCs-TBI組均沒有細(xì)胞克隆形成，并且移植到大鼠后，大鼠均無死亡，24周后未見腫瘤形成。而C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞有大量細(xì)胞克隆，移植到大鼠體內(nèi)具有相對安全性。

2.3大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試結(jié)果

在Morris水迷宮檢測大鼠定位航行試驗(yàn)中，TBI組與對照組比較，平均逃避潛伏期延長（P<0.05）。TERT-BMSCs-TBI組、BMSCs-TBI組與TBI組比較，平均逃避潛伏期縮短（P<0.05）。在空間探索試驗(yàn)中，TBI組大鼠在原平臺象限的停留時(shí)間明顯較對照組大鼠縮短；而TERT-BMSCs-TBI組、BMSCs-TBI組與TBI組比較，在原平臺象限的停留時(shí)間明顯延長（P<0.05）。結(jié)果提示，移植BMSCs后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，而移植轉(zhuǎn)染TERT的BMSCs后，其改善更為明顯（圖1）。

*P<0.05

圖1 各組大鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果的比較

2.4大鼠腦皮層的HE染色、光鏡下觀察結(jié)果

對照組大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，核仁核膜清晰可見，核仁染色均勻，核膜完整，胞質(zhì)染色呈均勻紅色。TBI組大鼠腦皮層見腦組織水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，神經(jīng)細(xì)胞有變形壞死改變，胞核可見空泡化及核體皺縮，胞漿氣球樣變及淡染。BMSCs-TBI組、TERT-BMSCs-TBI組與TBI組比較染色均有減輕，TERT-BMSCs-TBI組與BMSCs-TBI組比較染色減輕更顯著。

2.5大鼠腦皮層組織Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表達(dá)水平分析

Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，BMSCs-TBI組、TERT-BMSCs-TBI組腦皮層組織Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表達(dá)與TBI組比較均明顯升高（P<0.05），TERT-BMSCs-TBI組比BMSCs-TBI組顯著增加（P<0.05）（圖2）。

*P<0.05

圖2 各組大鼠腦組織Beclin1、Parkin、BDNF、NGF蛋白表達(dá)水平的比較

3討論

腦損傷后為了維持身細(xì)胞自身的穩(wěn)定會發(fā)生自噬，發(fā)生自噬時(shí)可以將已經(jīng)損壞的細(xì)胞器通過溶媒途徑講解，從而達(dá)到能量與蛋白的再循環(huán)[9]。Beclin1是自噬的調(diào)控基因[10]，是酵母自噬基因ATG6的同源物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因，主要調(diào)控自噬體的形成與成熟[11]。線粒體自噬是自噬的一種，在腦組織中PINK1/Parkin信號通路參與了細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬過程，在清除受損線粒體過程中發(fā)揮了重要作用[12]。Parkin分子定位到線粒體外膜對外膜蛋白進(jìn)行泛素化修飾，介導(dǎo)受損線粒體被自噬體包裹而降解[13-14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI組大鼠經(jīng)BMSCs、TERT-BMSCs移植后，Beclin1、Parkin的表達(dá)和大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著增強(qiáng)，其中TERT-BMSCs移植后增強(qiáng)更為顯著。

BMSCs是目前治療腦損傷的一個(gè)新的研究方向，BMSCs可以在體內(nèi)外誘導(dǎo)下分泌BDNF、NGF，還可以向神經(jīng)元方向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，BDNF、NGF抵御神經(jīng)細(xì)胞損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化和再生，本身還可向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對損傷腦組織起修復(fù)作用。但BMSCs生存周期短，在移植后對損傷腦組織的修復(fù)作用受限[15-16]。本研究通過構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體重組子pLXSN-TERT，獲得TERT調(diào)控的BMSCs，避免細(xì)胞過度衰老，穩(wěn)定其在體內(nèi)外的生長。研究結(jié)果提示，TBI組大鼠經(jīng)BMSCs、TERT-BMSCs移植后，BDNF、NGF的表達(dá)顯著增強(qiáng)，其中TERT-BMSCs移植后表達(dá)增強(qiáng)更為顯著。光鏡下觀察到，BMSCs-TBI組、TERT-BMSCs-TBI組與TBI組比較，腦細(xì)胞損傷均有減輕，TERT-BMSCs-TBI組與BMSCs-TBI組比較減輕更為顯著。

綜上所述，TERT-BMSCs移植對TBI有明顯的治療作用，促進(jìn)腦損傷后腦功能的重塑，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力的增強(qiáng)。但對TBI康復(fù)治療作用的具體機(jī)制是怎樣的還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-06-15 本文編輯：任 念）