自噬在不同強(qiáng)度運(yùn)動影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞功能中的作用

劉申申等

摘要：目的： 探討自噬在不同運(yùn)動強(qiáng)度影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞功能中的作用。方法： 將 SD 大鼠隨機(jī)分為 4 組： 高強(qiáng)度運(yùn)動組、中等強(qiáng)度運(yùn)動組、低強(qiáng)度運(yùn)動組和對照組，其中的三個運(yùn)動組大鼠均進(jìn)行每天 1 h持續(xù) 8 w 的跑臺運(yùn)動，運(yùn)動速度分別為 35 m/min、 25 m/min、 15 m/min，對照組不進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)。分組干預(yù)結(jié)束后處死大鼠， 取左后肢膝關(guān)節(jié)軟骨組織提取總 RNA 和蛋白，利用 qRT-PCR法檢測蛋白多糖和 II 型膠原纖維 mRNA 水平，利用 Western blot 法測定自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白 Beclin-1 和微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3（ microtubule-associated protein 1

light chain 3， LC3）的蛋白水平。 結(jié)果： 與對照組相比， 低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨外觀無明顯差異，蛋白多糖和 II 型膠原纖維 mRNA 水平以及Beclin-1 和 LC3-II/I 蛋白水平明顯升高；而高強(qiáng)度運(yùn)動組大鼠膝關(guān)節(jié)中出現(xiàn)少量積液，滑膜腫脹，關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)散在微小裂痕和纖維化表現(xiàn)，蛋白多糖和 II型膠原纖維 mRNA 水平以及 Beclin-1 和 LC3-II/I 蛋白水平顯著降低。 結(jié)論： 低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動可以通過促進(jìn)自噬維持軟骨細(xì)胞分泌功能，而高強(qiáng)度運(yùn)動則會誘發(fā)自噬缺陷并造成軟骨組織破壞。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動；運(yùn)動強(qiáng)度；關(guān)節(jié)軟骨； 軟骨細(xì)胞；自噬

中圖分類號：G8042文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-2076（2015）02-0074-05

Abstract：Objective： To determine the role of autophagy in the regulation of articular chondrocyte function with exercises of different intensityMethods：The rats were randomly divided into 4 groups： high， moderate， low intensity exercise groups and the control group The rats of exercise groups were trained in the form of treadmill running， 1 h/d for 8 weeks， with 35 m/min， 25 m/min， and 15 m/min respectively And the rats of the control group were not trained at all Finally， the knee articular cartilage of the left hind limb was harvested to determine the mRNA level of proteoglycan and type II collagen， and the protein level of Beclin-1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）Results：Compared with the control group， the gross appearance of the cartilage did not differ in the rats of moderate and low intensity exercise groups And the mRNA levels of proteoglycan and type II collagen and the protein level of Beclin-1 and LC3-II/I were all significantly

收稿日期：2014-11-11

基金項目：[河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（ Z2013009）。

作者簡介：[劉申申（1981-），男，河北文安人，碩士，講師，研究方向體育教學(xué)與訓(xùn)練。

作者單位：[1廊坊師范學(xué)院體育學(xué)院，河北 廊坊065000；2北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院，河北 廊坊065000

1School of Physical Education， Langfang Teachers University， Langfang 065000， Hebei， China；2Oriental College，Beijing University of Chinese Medicine，Langfang 065001

upregulated As a contrast， the mRNA and protein levels of those proteins were all significantly decreased， accomplished with arthroedema and cartilage destructionConclusion：The secretory function of the chondrocyte may be improved by low to moderate intensity exercise via an autophagy-dependent manner； however， autophagy defect may be induced by high intensity exercise to mediate cartilage destruction

Key words：exercise；exercise intensity；articular cartilage； chondrocyte； autophagy

[FL（K2]

關(guān)節(jié)是骨與骨相連接的部位，作為關(guān)節(jié)的重要組成部分，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)揮著減輕骨與骨之間摩擦和緩沖運(yùn)動時產(chǎn)生震動的作用。 膝關(guān)節(jié)是人體主要的負(fù)重關(guān)節(jié)之一，因此，膝關(guān)節(jié)軟骨除發(fā)揮上述作用外，還承擔(dān)著負(fù)重的作用。隨著年齡的增長， 累積性運(yùn)動損傷、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和制動、關(guān)節(jié)退行性改變和局部炎癥免疫反應(yīng)等因素共同作用，誘使膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)軟骨破壞、關(guān)節(jié)表面骨贅形成、滑膜細(xì)胞增生、關(guān)節(jié)間隙狹窄等病理改變，即誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎[1]。 骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病， 累積性微小損傷、肥胖和負(fù)重等外因參與誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，但其具體在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用尚未明確

自噬是細(xì)胞為維持自身穩(wěn)態(tài)而選擇性降解受損細(xì)胞器和生物大分子的一種應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，當(dāng)各種應(yīng)激因素刺激引起細(xì)胞損傷時， 細(xì)胞自噬水平代償性提高，細(xì)胞主動清除受損的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細(xì)胞器，從而有效延緩或阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生，有助于細(xì)胞功能乃至組織整體功能的維持和恢復(fù)[4-6]。 目前研究已經(jīng)證實，自噬在正常軟骨組織中發(fā)揮保護(hù)性作用，參與局部穩(wěn)態(tài)的維持， 而原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎和年齡、手術(shù)相關(guān)骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨局部自噬水平明顯降低，并可能與軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)[7-8]。然而，自噬在運(yùn)動相關(guān)性累積性微小損傷誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中的作用尚無研究闡明，為了明確上述問題，設(shè)計了如下實驗。本實驗擬利用動物實驗探討不同運(yùn)動強(qiáng)度運(yùn)動對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬和軟骨細(xì)胞分泌功能的影響，以闡明自噬在運(yùn)動相關(guān)性軟骨損傷乃至骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用。

1材料和方法

1.1動物和材料健康清潔級 8 周齡雄性 SD 大鼠 48 只（體重 180 g～230 g） 購自 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心； BW-ZH-PT 型動物跑臺購自上海軟隆科技發(fā)展有限公司； RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 SYBR 熒光試劑盒均購自日本 TaKaRa 公司； RIPA 裂解液購自西安沃爾森生物科技有限公司； 兔抗大鼠Beclin-1 多克隆抗體和兔抗大鼠 LC3 多克隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗大鼠 β-actin 抗體購自美國 Santa Cruz公司； 常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2分組和干預(yù)所有動物的飼養(yǎng)均在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心完成，飼養(yǎng)條件滿足環(huán)境溫度 20℃～25℃和相對濕度 50%～55%的條件。經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后， 將所有大鼠隨機(jī)分為4組： 高強(qiáng)度運(yùn)動組、中等強(qiáng)度運(yùn)動組、低強(qiáng)度運(yùn)動組和對照組（均為n=12）。其中，三個運(yùn)動組的大鼠均進(jìn)行每天 1 h持續(xù)8w的跑臺運(yùn)動， 運(yùn)動強(qiáng)度的確定參照 Bedford 等人所用方法[9]。高強(qiáng)度運(yùn)動組運(yùn)動速度為 35 m/min，中等強(qiáng)度運(yùn)動組運(yùn)動強(qiáng)度為 25 m/min，低強(qiáng)度運(yùn)動組運(yùn)動強(qiáng)度為 15 m/min，對照組不進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)。

1.3標(biāo)本采集和處理 分組干預(yù)結(jié)束后， 統(tǒng)一斷頭處死各組大鼠，迅速切取左后肢膝關(guān)節(jié)軟骨， 觀察關(guān)節(jié)軟骨表面形態(tài)特征，隨后立即放入液氮中保存，后期用于提取總 RNA 和總蛋白，分別測定軟骨組織 II 型膠原纖維 mRNA、蛋白多糖mRNA 以及 Beclin-1 和微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3（ microtubule-associated protein 1light chain 3， LC3）蛋白水平。

1.4改良異硫氰酸胍一步法提取總 RNA 參照馬秦和邱蔚六等人所報道的方法提取軟骨組織總 RNA[10]，具體步驟如下：切取約 2 g 軟骨組織，在液氮中研碎，加入20 mL含4 mol/L異硫氰酸胍的混合液（含25 mmol/L 檸檬酸鈉、 5 g/L 十二烷基磺酸鈉和 01 mol/L 巰基乙醇），室溫緩慢震蕩 4 h；再分別加入水飽和酚20 mL、 2 mol/L 醋酸鈉溶液 2 mL 和含 20 mL/L 異戊醇的氯仿 5 mL，室溫劇烈震蕩 10 s 后立即放入冰水混合物中孵育 15 min； 12 000 g離心15 min，將上層無色透明的樣本轉(zhuǎn)移到新的 EP管中，加入等體積異丙醇，充分混勻后室溫下孵育10 min，再次離心；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀1次，將所提取 RNA 沉淀晾干后，加入 50 μL DEPC溶解RNA，于紫外分光光度計測定RNA純度，保證A260/280不超過 16，RNA樣本保存于-80℃冰箱備用。

1.5總蛋白提取將約 01 g 軟骨組織在液氮中研碎后，加入 998 μL RIPA 裂解液（含 1 μL 苯甲磺酰氟），冰上裂解 30 min；將裂解液轉(zhuǎn)移至 EP 管中， 4℃ 14 000 g離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新EP管中；加入 1/4 體積 5× 十二烷基磺酸鈉上樣緩沖液， 95℃ 10 min 使蛋白變性， 保存于-20℃冰箱中備用。

1.6qRT-PCR分別按照以下基因序列合成引物：II型膠原纖維為5-CGAGGTGACAAAGGAGC-3（正義），5-CTGGTTGTTCAGCGACTTGA-3（反義）；蛋白多糖為 5-CGCTTGCCAGGGGGAGTTGTATTC-3 （正義），5-GGAGGCCAGGGTAGCATTTTGAGC-3 （ 反 義 ）； 內(nèi) 參 GAPDH 為5-GATGGTGAAGGTCGGTGTG-3（正義）， 5-GAGGTCAATGAAGGGGTCG-3（反義）。設(shè)置微量反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，在 iQ5 熒光定量RT-PCR 儀上進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。每個實驗重復(fù)進(jìn)行 5 次，每次設(shè)置 3 個復(fù)孔，以2-ΔΔC（t）法計算目的基因相對表達(dá)量，以 GAPDH 為內(nèi)部對照。

1.7Western blot利用Bradford 法測定蛋白濃度， 取等質(zhì)量的關(guān)節(jié)軟骨總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳； 以半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到 PVDF 膜， 室溫下常規(guī)封閉處理2 h，隨后分別用抗Beclin-1抗體（1[JX-4]：[JX4]100）、抗LC3抗體（1[JX-4]：[JX4]2 000）或β-actin單克隆抗體（1[JX-4]：[JX4]3 000）4℃孵育過夜，用含Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌后，在室溫下加入1[JX-4]：[JX4]8 000稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體孵育2 h，用含Tween-20 的磷酸鹽緩沖液充分洗滌后，用ECL法顯影，在Image-Pro Plus 軟件中分析各蛋白條帶的積分吸光度值，以β-actin為內(nèi)對照，目的蛋白與內(nèi)對照灰度值的比值代表該樣本目的蛋白的相對表達(dá)量， 以3次重復(fù)檢測所得平均值為該樣本目的蛋白表達(dá)水平，樣本量為n=5。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS180統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 兩組間比較采用 t 檢驗，以P<005 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)特征

經(jīng)過 8 w 不同強(qiáng)度運(yùn)動后， 對照組與低強(qiáng)度、中等強(qiáng)度運(yùn)動組大鼠膝關(guān)節(jié)中無明顯關(guān)節(jié)積液，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，滑膜無腫脹，未見軟骨表面出現(xiàn)裂痕或纖維化表現(xiàn)；而高強(qiáng)度運(yùn)動組膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見少許積液，滑膜腫脹，關(guān)節(jié)軟骨表面可見散在微小裂痕和纖維化表現(xiàn)。

2.2大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌功能測定

基質(zhì)和纖維成分是關(guān)節(jié)的主要組成部分， 主要由軟骨細(xì)胞合成并分泌。在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，軟骨細(xì)胞合成分泌蛋白多糖和II型膠原纖維不足，導(dǎo)致軟骨表面破損后不能及時修復(fù)，直接引發(fā)關(guān)節(jié)功能降低。為了探索不同強(qiáng)度運(yùn)動對軟骨細(xì)胞分泌功能的影響以及自噬在其中的作用，本實驗利用 qRT-PCR 法測定了各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖和 II 型膠原纖維的 mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果如圖1 所示，與對照組相比，低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖mRNA 表達(dá)水平明顯升高，但高強(qiáng)度運(yùn)動組顯著降低（均為P<005）。 各組大鼠II 型膠原纖維水平變化趨勢大致與蛋白多糖相似，低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動可促使II 型膠原纖維表達(dá)水平升高，而高強(qiáng)度運(yùn)動則顯著抑制其表達(dá)水平（均為P<005，圖2）。

2.3大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨自噬水平測定

LC3 是大鼠軟骨細(xì)胞自噬體形成所必需的組分，在自噬體膜的延長和融合中發(fā)揮重要的作用，也因此被視為自噬水平的標(biāo)志物[11 -12]。Beclin-1 是哺乳動物自噬調(diào)控的重要分子，主要參與調(diào)節(jié)其他自噬蛋白向前自吞噬體膜的募集和定位[13]。為了探討不同運(yùn)動強(qiáng)度對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨自噬水平的影響， 本實驗利用Western blot 法測定了關(guān)節(jié)軟骨中自噬標(biāo)志物Beclin-1 和 LC3 的蛋白水平。結(jié)果如圖 3 所示，與對照組相比，低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中 Beclin-1和LC3 的蛋白水平明顯升高，而高強(qiáng)度運(yùn)動組則顯著降低（均為P<005）。

3討論

適當(dāng)運(yùn)動有助于維持關(guān)節(jié)軟骨生理功能，而高強(qiáng)度運(yùn)動可直接引起關(guān)節(jié)軟骨損傷，甚至誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，然而不同強(qiáng)度運(yùn)動影響關(guān)節(jié)軟骨功能的機(jī)制目前尚未明確[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可以上調(diào)膝關(guān)節(jié)軟骨自噬水平，而高強(qiáng)度跑臺運(yùn)動卻顯著抑制軟骨自噬，軟骨細(xì)胞分泌功能也出現(xiàn)相同的變化趨勢，這說明自噬可能是不同強(qiáng)度運(yùn)動調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌功能的機(jī)制之一。

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快、生活習(xí)慣的西方化和戶外運(yùn)動的減少，亞健康群體正在日益擴(kuò)大。體育運(yùn)動具有預(yù)防和消除亞健康的作用，是促進(jìn)機(jī)體從亞健康狀態(tài)向軀體健康和心理健康發(fā)展的重要手段。近年來，人們主動參加戶外活動，提高身心健康水平的意愿愈發(fā)強(qiáng)烈，選擇適宜的運(yùn)動強(qiáng)度和方式則成為影響戶外活動效果的重要因素[15]。既往研究表明，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動可以顯著改善軟骨細(xì)胞合成和分泌糖胺多糖， 維持軟骨組織正常功能，并具有促進(jìn)軟骨重建的功能[16]。 進(jìn)一步研究表明，中等強(qiáng)度運(yùn)動主要通過增加軟骨中基質(zhì)成分（主要為蛋白多糖和 II 型膠原纖維）的表達(dá)和合成而實現(xiàn)促進(jìn)軟骨塑性的保護(hù)作用[17-19]。本實驗利用 SD 大鼠跑臺運(yùn)動構(gòu)建不同運(yùn)動強(qiáng)度的動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動均可促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成和分泌蛋白多糖和 II 型膠原纖維， 這可能是運(yùn)動造成軟骨磨損和基質(zhì)消耗后，軟骨細(xì)胞自身的代償性保護(hù)機(jī)制。

[JP+1]自噬是真核細(xì)胞中物質(zhì)分解代謝的主要途徑之一，正常細(xì)胞中自噬處于較低水平，而當(dāng)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器自然衰老或受損傷后，細(xì)胞主動啟動自噬相關(guān)信號分子，形成自噬體并與溶酶體結(jié)合，清除上述細(xì)胞器及生物大分子[20]。既往研究表明，適當(dāng)?shù)淖允伤接兄陲@著線粒體合成并釋放過多的活性氧，并可以維持線粒體功能，防止出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可以明顯提高軟骨組織自噬相關(guān)標(biāo)識蛋白 Beclin-1 和 LC3 的表達(dá)水平，這說明適當(dāng)運(yùn)動可以提升軟骨細(xì)胞自噬活性，有助于清除運(yùn)動中受損的細(xì)胞器或細(xì)胞外基質(zhì)，維持軟骨組織局部穩(wěn)態(tài)，而軟骨組織穩(wěn)態(tài)的維持也是保證軟骨細(xì)胞代償性合成并分泌蛋白多糖和 II 型膠原纖維的重要前提和基礎(chǔ)。因此，自噬水平的提高可能是低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動改善軟骨代謝的重要機(jī)制之一，這為適當(dāng)運(yùn)動方式的選擇提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。[JP]

與低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動不同，高強(qiáng)度運(yùn)動主要見于專業(yè)運(yùn)動員。長期從事高強(qiáng)度的沖擊性或扭轉(zhuǎn)剪切性運(yùn)動難免造成膝關(guān)節(jié)等部位的運(yùn)動損傷，甚至可以誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎等疾病。膝關(guān)節(jié)運(yùn)動損傷主要表現(xiàn)為半月板磨損或撕裂、韌帶撕裂或斷裂，在上述疾病發(fā)生過程中，關(guān)節(jié)軟骨損傷最常見。 關(guān)于高強(qiáng)度運(yùn)動誘發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的機(jī)制研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：高強(qiáng)度運(yùn)動可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶3表達(dá)升高[22]，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 1 的表達(dá)[23]，從而促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解。然而，高強(qiáng)度運(yùn)動是否影響軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)成分的能力以及自噬在其中的作用均未完全闡明，本實驗結(jié)果提示高強(qiáng)度運(yùn)動可以下調(diào) Beclin-1 和 LC3 蛋白水平，誘導(dǎo)軟骨自噬缺陷，這一現(xiàn)象可能會造成軟骨組織局部物質(zhì)分解代謝能力不足，引起受損細(xì)胞器和無活性生物大分子蓄積，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重軟骨基質(zhì)成分合成不足，造成惡性循環(huán)，參與運(yùn)動性軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程[24]。

4總結(jié)

綜合上述實驗結(jié)果，低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動可以誘導(dǎo)軟骨自噬活性并發(fā)揮一定的保護(hù)作用，而高強(qiáng)度運(yùn)動可引起軟骨自噬缺陷繼而誘導(dǎo)軟骨損傷，這說明不同運(yùn)動強(qiáng)度對軟骨自噬水平的不同調(diào)節(jié)作用可能是其對軟骨功能影響截然不同的機(jī)制之一。本研究結(jié)果也為進(jìn)一步探討自噬在運(yùn)動相關(guān)性軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用提供了一定的科學(xué)依據(jù)， 而繼續(xù)研究運(yùn)動影響自噬的分子機(jī)制將是本課題組下一步的研究方向。

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