流式細(xì)胞分析在動物學(xué)研究中的應(yīng)用

梅麗+侯東敏+朱萬龍+張海姬+諶立新+王政昆

摘要：指出了流式細(xì)胞分析（Flow cytometry， FCM）是運(yùn)用流式細(xì)胞儀對液相中懸浮細(xì)胞或微粒進(jìn)行研究的新興技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，它具有檢測速度快、靈敏度高，且操作簡便等特點(diǎn)。介紹了流式細(xì)胞儀的發(fā)展及其原理，闡述了流式細(xì)胞分析在動物學(xué)研究中的應(yīng)用，包括在水生動物、哺乳動物以及動物病理學(xué)研究等方面的應(yīng)用，并對其進(jìn)行了總結(jié)與展望，為流式細(xì)胞分析的進(jìn)一步發(fā)展提供參考，以期流式細(xì)胞儀在動物學(xué)研究中得到更好的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞分析；流式細(xì)胞儀；動物學(xué)

中圖分類號：Q95

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）14-0163-05

1 引言

流式細(xì)胞分析是利用流式細(xì)胞儀對熒光分子標(biāo)記的動植物細(xì)胞、細(xì)菌、病毒以及其中的DNA、RNA、各種蛋白或其它分子進(jìn)行研究，也可用于研究塑料微球或其他懸浮于液體中的微粒，是對液相中的細(xì)胞或微粒進(jìn)行參數(shù)快速分析和分選的技術(shù)[1]。流式細(xì)胞儀集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體[2]，靈敏度高、測量速度快、被測群體大且能進(jìn)行多參數(shù)測量，即對同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、生物化學(xué)特性的多參數(shù)測量[3～5]。目前已廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域，特別是在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域得到較快的發(fā)展。在生物學(xué)中，流式細(xì)胞儀用于植物研究中較少，而在動物學(xué)中的應(yīng)用相對較多。

2 流式細(xì)胞儀的發(fā)展及原理

1934年，Andrew Moldaran開始了流式細(xì)胞分析的第一步，他通過顯微鏡技術(shù)，發(fā)明了一個(gè)能讓細(xì)胞通過毛細(xì)管，并能對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的儀器[1]。1953年，Parker和Hutcheon描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為了流式細(xì)胞儀的雛形[6]。1967年，Kamentsky和Melamed在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了分選儀器，它能給注射器提供電刺激，從液流中找出目標(biāo)細(xì)胞，再進(jìn)行觀察分析，這就是流式分選的雛形[1]。1969年，Marvin van Dilla報(bào)道了第一臺熒光檢測的流式細(xì)胞儀，它用氬離子激光作為光源，包括照射、電子檢測以及液流系統(tǒng)[1]。后來，流式細(xì)胞儀朝著能檢測和分選不同類型細(xì)胞的大型機(jī)以及功能越來越強(qiáng)大、系統(tǒng)穩(wěn)定發(fā)展的小型機(jī)兩個(gè)方向發(fā)展[1]。

流式細(xì)胞儀的原理：目前使用的流式細(xì)胞儀包括4個(gè)系統(tǒng)：液流系統(tǒng)、光學(xué)檢測系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)以及分析系統(tǒng)[1]。具有分選功能的流式細(xì)胞儀還具有分選系統(tǒng)[7]。其原理是進(jìn)行熒光染色的懸浮細(xì)胞或微粒在壓力下，經(jīng)鞘液包繞形成鞘流，依次進(jìn)入流式照射室的檢測點(diǎn)，氬離子激光照射細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，其信號強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)待測組分含量成正比[1，6]。散射光和熒光被前向光電二極管和側(cè)向90°方向的光電倍增管接收放大后轉(zhuǎn)化成電信號，再經(jīng)轉(zhuǎn)換器形成數(shù)據(jù)文件，儲存在計(jì)算機(jī)上，以備脫機(jī)后的數(shù)據(jù)處理和分析[7]。

流式細(xì)胞儀的分選原理：具有分選功能的流式細(xì)胞儀通過細(xì)胞分選器分離含有單細(xì)胞的液滴完成細(xì)胞分選檢測。由噴嘴噴射出的液流柱經(jīng)高頻的壓電晶體產(chǎn)生高頻振蕩，斷裂形成均勻的液滴，根據(jù)選定的參數(shù)判明是否將被分選，而后對選定的細(xì)胞液滴充上正或負(fù)電荷，當(dāng)帶電液滴通過靜電場發(fā)生偏轉(zhuǎn)，后落入收集器中，通過不同孔徑的噴孔及液流速度，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選[6，8]。

3 流式細(xì)胞分析在動物學(xué)中的應(yīng)用

近年來，隨著生物學(xué)研究的深入，流式細(xì)胞分析作為一種重要輔助研究的方法被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，特別是動物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。

我國對流式細(xì)胞儀的研發(fā)起步較晚。1981年，北京師范大學(xué)生物系引進(jìn)了國內(nèi)第一臺流式細(xì)胞儀[7]。此后，流式細(xì)胞分析不僅在科研領(lǐng)域，而且在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了較快的發(fā)展。

流式細(xì)胞分析最早用于細(xì)胞的分選以及血細(xì)胞的分類研究。1975年，Gray[9]首次運(yùn)用流式細(xì)胞儀觀察用DNA熒光染料染色的中國倉鼠（Cricetulus barabensis griseus）細(xì)胞中的染色體，根據(jù)染色體上染色含量的不同將單個(gè)染色體進(jìn)行分揀。1984年，De Laat 和 Blass[10]首次報(bào)道了運(yùn)用流式細(xì)胞分析識別和分揀植物染色體。國內(nèi)最早的流式細(xì)胞分析應(yīng)用是許秀芹，王宜艷[11]等學(xué)者，其利用流式細(xì)胞分析將海灣扇貝、蝦夷扇貝、太平洋牡蠣等的血細(xì)胞分成透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞3個(gè)亞群。

3.1 流式細(xì)胞分析在水生動物中的應(yīng)用

流式細(xì)胞分析早期應(yīng)用于水生生物的研究中。沙愛龍[1]在Ashton-Alcox[12]與劉東武[13]等國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞分析將美洲牡蠣、中國蛤蜊和紫石房蛤的血細(xì)胞分為3類的基礎(chǔ)上，利用流式細(xì)胞儀將短蛸的血細(xì)胞分為大透明細(xì)胞、小透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞4種類型，他的研究表明與王晶[14]的活體染色方法相比，流式細(xì)胞分析更為方便可行，研究結(jié)果也更為精確。此外，沙愛龍[1]還概述了流式細(xì)胞分析在水生無脊椎動物細(xì)胞免疫學(xué)、染色體核型分析、無脊椎動物細(xì)胞核等方面的應(yīng)用，并提出隨著流式細(xì)胞儀的發(fā)展，它將會應(yīng)用到無脊椎動物的生殖與遺傳研究中，推動其分子細(xì)胞水平的研究。高如承[15]等就流式細(xì)胞分析在水生動物細(xì)胞分類、分選、細(xì)胞免疫功能、DNA研究以及精子質(zhì)量評價(jià)方面進(jìn)行了綜述。流式細(xì)胞儀能快速、準(zhǔn)確地量化大量單細(xì)胞的形態(tài)和功能，能更好地了解雙殼類機(jī)體的免疫狀況，從而保證養(yǎng)殖業(yè)更好地發(fā)展。Michael等在單細(xì)胞水平上利用熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞儀對美國東部的牡蠣防御機(jī)制進(jìn)行了量化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞的吞噬活性和呼吸爆發(fā)活力最強(qiáng)，中間顆粒細(xì)胞次之，透明細(xì)胞無活性[15，16]。Helene Hegaret[17]等應(yīng)用流式細(xì)胞分析對牡蠣血細(xì)胞的凝集、吞噬作用、生存能力以及呼吸爆發(fā)等功能在溫度升高（20～28℃）前后進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞具有較高的免疫性，有可能在免疫防御中起關(guān)鍵作用[18]。

應(yīng)用流式細(xì)胞分析進(jìn)行染色體核型分析是在1975年首次使用流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的，與傳統(tǒng)核型分析相比，它操作更為簡單準(zhǔn)確，且流式細(xì)胞分析還能對染色體進(jìn)行純化，得到克隆實(shí)驗(yàn)所要求的染色體，這是目前其他技術(shù)無法完成的[2]。測定細(xì)胞DNA含量時(shí)，用DNA特異性熒光染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，激光激發(fā)后，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞DNA含量成正比，因此可得到被測細(xì)胞的DNA含量，從而可進(jìn)行染色體倍性鑒定，但必須用已知DNA含量的細(xì)胞群體做參照[15，19]。

流式細(xì)胞分析還可用于生物精子質(zhì)量評價(jià)，但其在水生生物精子評價(jià)中利用較少[20，21]。高如承[15]綜述了國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞分析評估水生動物精子的質(zhì)膜完整性及線粒體活性的報(bào)道，但細(xì)胞凋亡方面未見報(bào)道，主要報(bào)道是對其它細(xì)胞的凋亡研究，流式細(xì)胞分析在此方面的應(yīng)用多見于哺乳動物。

3.2 流式細(xì)胞分析在哺乳動物中的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀目前已成為生物研究中廣為用之的儀器，它不僅能用于水生生物的血細(xì)胞分類、分選、細(xì)胞免疫機(jī)制、染色體核型分析等方面，而且在哺乳動物研究中的運(yùn)用更為廣泛。

3.2.1 分離哺乳動物的精子

人為地對精子類型進(jìn)行選擇，產(chǎn)生人類期望的性別后代，能促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。哺乳動物（家畜）中，有兩條染色體，后代性別主要由父代的X/Y染色體決定，通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%～4.5%[22，23]。應(yīng)用用流式細(xì)胞分析對哺乳動物的精子進(jìn)行分離，可獲得高純度的X/Y精子群[24]，且分離速度快、準(zhǔn)確性高。其原理是根據(jù)DNA含量的差異及所結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光強(qiáng)度差別分辨出X、Y精子，利用流式細(xì)胞儀的分選原理，通過產(chǎn)生振蕩，將液流斷裂形成含X或含Y精子的均勻液滴，然后充上正（X精子）或負(fù)電荷（Y精子），經(jīng)電場力的引導(dǎo)落入不同的收集器中，即可分離精子[24，25]。1989年首次采用了流式細(xì)胞分析分離了兔的XY精子，隨后，這一技術(shù)逐漸應(yīng)用于豬、牛、羊的精子分離[26]。高慶華[27]運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)初步建立了山羊、梅花鹿和馬鹿分選精液的低劑量受精技術(shù)體系且進(jìn)一步采用扣除雜交篩選奶牛精液，初步獲得牛XY精子間的差異表達(dá)基因。曲蕾[22]等綜述了流式細(xì)胞分析在哺乳動物精子分離中的應(yīng)用以及影響精子分離效率的因素，她指出染色液及流式細(xì)胞儀在分離時(shí)對精子活力有一定影響，所以應(yīng)選擇適當(dāng)濃度的染色液。馬利兵[26]等提出了流式細(xì)胞分析在分離哺乳動物的性別中的注意事項(xiàng)，表明對分離后的精子采用自然沉淀法進(jìn)行濃縮可避免精子活力下降。

3.2.2 檢測哺乳動物精液質(zhì)量

通過精液質(zhì)量檢測測定精子的活力，在臨床不孕癥治療及家畜繁殖中具有重要作用。利用流式細(xì)胞分析檢測反映精子活性的多個(gè)指標(biāo)，例如精子質(zhì)膜完整性、頂體狀態(tài)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性等，測定精子的生育能力，這種方法適合自然狀態(tài)下的精子檢測，需結(jié)合熒光顯微鏡，與傳統(tǒng)方法相互驗(yàn)證使用，其檢測速度快，且便捷準(zhǔn)確[28]。

3.2.3 流式細(xì)胞分析與細(xì)胞增殖、凋亡

何旦莎[30]等采用流式細(xì)胞儀對經(jīng)特異性熒光染料染色不同年齡的大鼠腦組織的DNA進(jìn)行含量的測定，結(jié)果表明，不同年齡不同部位的腦組織增殖程度不同，且同一部位的腦組織在不同年齡階段，增殖情況也存在差異。

也可利用流式細(xì)胞分析對DNA含量、線粒體膜、Ca2+濃度進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞凋亡情況[30]。王磊[31]等利用流式細(xì)胞分析對正常大鼠紅細(xì)胞、老齡大鼠紅細(xì)胞以及2型糖尿病大鼠紅細(xì)胞進(jìn)行研究，對比生理和病理兩種情況對紅細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：糖尿病大鼠大量紅細(xì)胞存在凋亡，且血液黏稠度增大，其他兩類大鼠紅細(xì)胞不存在凋亡。因此，可以看出紅細(xì)胞凋亡與年齡無關(guān)，而與血液黏度有關(guān)。同樣，也可利用流式細(xì)胞分析顯示DNA含量直方圖，分析細(xì)胞周期，但它只能分辨出G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞[32]。后來，覃吉超[33]等在Cyclin的時(shí)相性表達(dá)理論[34]基礎(chǔ)上建立了Cyclin E+A/DNA 多參數(shù)FCM，實(shí)現(xiàn)了將細(xì)胞周期分為6個(gè)時(shí)期的細(xì)胞群體，尤其是促進(jìn)了G1期的進(jìn)一步研究。

3.3 流式細(xì)胞儀在動物病理學(xué)研究中的應(yīng)用

3.3.1 在動物免疫疾病中的應(yīng)用

對CD抗原的分析可以反映淋巴細(xì)胞的分型和機(jī)體的免疫狀態(tài)[35]。淋巴細(xì)胞可分為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等幾類[36，37]。根據(jù)CD3、CD19在T、B淋巴細(xì)胞上的作用，以及CD19在B淋巴細(xì)胞分化為成熟的漿細(xì)胞之后會丟失，可利用流式細(xì)胞分析檢測淋巴細(xì)胞表面的CD3和CD19，從而計(jì)算淋巴組織中T、B細(xì)胞的含量[38]。外周血T淋巴細(xì)胞亞群（CD+4/CD+8）在機(jī)體正常情況下比值是一定的，約2∶1，但是當(dāng)機(jī)體細(xì)胞免疫力低下時(shí)會出現(xiàn)比例下降[25，35]。這可用于檢測機(jī)體免疫疾病，例如，人體被HIV感染后，大量CD+4細(xì)胞被破壞，其比值小于1。但是當(dāng)自身免疫功能亢奮時(shí)會引起如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病[35]。楊蕾芳[39]等利用流式細(xì)胞儀檢測小鼠感染附紅細(xì)胞后，在不同組不同時(shí)間段CD4、IL-17的表達(dá)變化，探討Th17細(xì)胞發(fā)揮的免疫學(xué)功能。結(jié)果表明小鼠感染附紅細(xì)胞后Th17細(xì)胞增多，因此推測Th17細(xì)胞可能在附紅細(xì)胞體感染過程中發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)。屈雪琪[40]等利用流式細(xì)胞儀檢測不同方式處理以及不同保存時(shí)間的豬淋巴細(xì)胞，探討其對T淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+亞群的影響。

3.3.2 流式細(xì)胞分析在巨噬細(xì)胞功能檢測中的作用

巨噬細(xì)胞具有吞噬、清除及呈遞抗原異物的生物學(xué)功能，屬于免疫系統(tǒng)的重要成員，是維持機(jī)體的正常生理狀態(tài)所必需的，其與許多重大疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

1982年，Steinkamp首創(chuàng)熒光微球流式細(xì)胞分析定量檢測吞噬功能，目前，流式細(xì)胞分析在單核—巨噬細(xì)胞吞噬功能研究中得到廣泛應(yīng)用。黃瓊[41]等利用流式細(xì)胞儀觀察在不同處理溫度、不同孵育時(shí)間下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球或熒光素標(biāo)記大腸桿菌的能力，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度及孵育時(shí)間的延長，吞噬百分率會增大。流式細(xì)胞分析檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力較傳統(tǒng)方法更準(zhǔn)確，且快速、高效，可應(yīng)用于評價(jià)保健食品對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[41]。金齊力等[42]通過不同濃度熒光素標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌以及不同孵育時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，建立流式細(xì)胞分析檢測單核巨噬細(xì)胞吞噬熒光素標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌的方法，表明該方法簡便、快速且重復(fù)性好。

3.3.3 流式細(xì)胞分析在血小板聚集功能檢測與臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2013年，國外學(xué)者報(bào)道了一種基于流式細(xì)胞分析檢測血小板聚集率的新方法[43]。在此基礎(chǔ)上，梅金平[44]等用CD61-PE和CD61-PITC標(biāo)記經(jīng)ADP、川芎嗪等處理后的小鼠血小板，通過流式細(xì)胞儀檢測兩種熒光染料的細(xì)胞群占所有血小板的百分比來評估血小板的聚集功能。結(jié)果顯示，不同處理對小鼠血小板的影響不同。小鼠作為一種模式生物，與人類親源性較高，基于流式細(xì)胞分析的小鼠血小板聚集活性檢測方法，在臨床醫(yī)學(xué)上對血小板相關(guān)的基礎(chǔ)研究以及抗血小板藥物篩選平臺具有借鑒價(jià)值。

流式細(xì)胞儀在臨床醫(yī)學(xué)中最早應(yīng)用于腫瘤學(xué)中，通過對DNA含量變化的測定，對癌變過程作出判斷，這利于癌前病變的有效措施，在以后的化療過程以及預(yù)后評估等工作中也能起到指導(dǎo)作用[45～47]。流式細(xì)胞分析也可用于檢測人體器官移植后的排斥反應(yīng)，通常檢測受體器官與供體器官二者血清中是否有相同的抗體或者檢測移植后受體的免疫狀態(tài)[48，49]。

4 總結(jié)與展望

流式細(xì)胞分析最早用于水生動物血細(xì)胞的分類及分選，之后在哺乳動物中得到廣泛應(yīng)用。本文綜述了流式細(xì)胞分析在水生生物、哺乳動物以及在動物病理學(xué)中的應(yīng)用。因流式細(xì)胞儀檢測速度快、靈敏度高且能進(jìn)行多參數(shù)測量，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展以及流式細(xì)胞分析的成熟，流式細(xì)胞儀不僅在生物學(xué)中取得良好發(fā)展，尤其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。生物學(xué)與醫(yī)學(xué)是相輔相成的，生物學(xué)是醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)，尤其動物學(xué)與醫(yī)學(xué)是密不可分的，其發(fā)展也將推動醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。

流式細(xì)胞在生物學(xué)中的用途廣泛，不但可以分揀染色體或根據(jù)檢測DNA的含量而進(jìn)行動物性別的選擇以及細(xì)胞周期的檢測，而且可以通過分析表面抗原檢測機(jī)體的免疫情況，從而推測是否患病等。流式細(xì)胞分析在家禽中的應(yīng)用較少，僅出現(xiàn)根據(jù)DNA含量不同，在出雛前對雞胚性別鑒定的報(bào)道，后期可在家禽方面增加流式細(xì)胞分析的應(yīng)用，用以發(fā)展經(jīng)濟(jì)。由于流式細(xì)胞儀所用熒光染料價(jià)格昂貴，且細(xì)胞懸液的制備過程、細(xì)胞熒光的染色程度、細(xì)胞流速的穩(wěn)定性以及激光光源的穩(wěn)定性等多種因素會影響檢測結(jié)果[15]。因此，流式細(xì)胞術(shù)的研究可向價(jià)廉物美的熒光染料開發(fā)、細(xì)胞制備方法以及提高電子信號處理能力方向進(jìn)行[15]。相信隨著流式細(xì)胞分析的進(jìn)一步發(fā)展，圖像以及分析軟件的研發(fā)，流式細(xì)胞儀會具有廣闊的應(yīng)用前景，在動物學(xué)研究中將會發(fā)揮更大的作用，進(jìn)一步推動生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]杜立穎， 馮仁青. 流式細(xì)胞術(shù)[M]. 北京： 北京大學(xué)出版社， 2008：1～15.

[2]沙愛龍. 流式細(xì)胞儀在無脊椎動物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2009（2）：58～61.

[3]宋平根， 李素文. 流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用[M]. 北京：北京師范大學(xué)出版社， 1992：1～51，108～207.

[4]謝小梅， 許 楊. 流式細(xì)胞術(shù)[J]. 中國生物工程雜志， 2003， 23（9）：100～104.

[5]楊 蕊， 鄒明強(qiáng). 流式細(xì)胞術(shù)的最新進(jìn)展[J]. 分析測試學(xué)報(bào)， 2004， 23（6）：124～128.

[6]魏熙胤， 牛瑞芳. 流式細(xì)胞儀的發(fā)展歷史及其原理和應(yīng)用進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代儀器， 2006（4）：8～11.

[7]趙書濤， 武曉東， 王 策，等. 流式細(xì)胞儀的原理、應(yīng)用及最新進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2011（22）：4378～4381.

[8]趙 泓， 劉 凡. 流式細(xì)胞儀[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2006（12）：39～41+80.

[9]Gray J. W.， Carrano A. V.， Steinmetz L. L.， et al. Chromosome Measurement and sorting by flow systems[J]. Proe Nat Acad Sci USA， 1975（72）：1231～1234.

[10]De Laat A. M. M.， Blass J.. Flow cytometric characterization and sorting of plant chromosomes[J]. Theor Appl Genet， 1984（67）：463～467.

[11]Allam B.， Ashton-Alcox K.A.， Ford S.E.. Flow cytometric comparison of haemocytes from three species of bivalve molluscs[J]. Fish & Soudant Immunology， 2002（13）：141～158.

[12]Ashton-Alcox K. A.， Ford S. E. Variability inmolluscan hemocytes：a flow cytometric study[J]. Tissue & Cell， 1998， 30（2）：195～204.

[13]劉東武， 王宜艷， 孫虎山. 菲律賓蛤仔、中國蛤蜊、文蛤和紫石房蛤血細(xì)胞的分類研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)， 2005， 24（10）：5～7.

[14]王 晶， 樊廷俊， 姜國建， 等. 短蛸血細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、類型、細(xì)胞化學(xué)特性及其吞噬活性研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版）， 2007， 42（5）：79～ 85.

[15]高如承， 吳麗云. 流式細(xì)胞儀在水生動物研究中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)（上半月刊）， 2010（23）：15～17+23.

[16]Michael G.， Sylvain D. G.. Flow cytometry as a tool to quantify oyster defence mechanisms[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2004（16）：539～552.

[17]Hegaret H.， Gary H. W.， Soudant Philippe. Flow cytometric analysis of haemocytes from eastern oysters， Crassostrea virginca，subjected to a sudden temperature elevation II.Haemocyte functions：aggregation， viability， phagocytosis， and respiratory burst[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology， 2003（293）：249～265.

[18]Goedken Michael， Guise Svlvain De. Flow cytometry as a tool quantify oyster defence mechanisms[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2004（16）：539～552.

[19]王海娜. 流式細(xì)胞儀在海洋無脊椎動物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)儀器， 2008（8）：43～45.

[20]Magda L.， Clarissa G.， Marcela S.. The use of flow cytometry in the evaluation of cell viability of cryopreser-ved sperm of the marine shrimp（Litopenaeus vannamei）[J]. Cryobiology， 2000（48）：349～356.

[21]Lewin L. M.， Golan R.， Feridlin P.， et al. Comparative study of spermatozoal chromatin using acridine orange staining and flow cytometry[J]. Comp Biochem Physiol， 1999（124A）：133～137.

[22]曲 蕾， 李建平， 蘇 權(quán)，等. 流式細(xì)胞分離法在哺乳動物精子分離中的應(yīng)用及前景[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2016（20）：72～74.

[23]陸陽清， 張 明， 盧克煥. 流式細(xì)胞儀分離精子法的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2005（3）：26～29.

[24]張夙夙. 哺乳動物XY精子分離技術(shù)的研究[J]. 畜牧與飼料科學(xué)， 2014， 35（7/8）：56～57.

[25]馬端輝， 莊金秋， 申識川. 流式細(xì)胞儀的原理及其在畜牧獸醫(yī)中的應(yīng)用[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2007（2）：103～106.

[26]馬利兵， 潘建剛， 王鳳梅，等. 流式細(xì)胞技術(shù)在哺乳動物性別控制中的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2009（3）：22～23.

[27]高慶華. 精子流式分離和低劑量授精研究及XY精子差異表達(dá)基因篩選[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2009.

[28]采克俊， 司 維， 李亞輝， 等. 流式細(xì)胞術(shù)在哺乳動物精液質(zhì)量檢測中的應(yīng)用[J]. 動物學(xué)研究， 2003（4）：311～317.

[29]何旦莎， 呂明雄， Sye F. A.， Ronald W. H.. 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析不同年齡大鼠腦組織細(xì)胞周期增殖特性[J]. 廣東解剖學(xué)通報(bào)， 1994（2）：107～111.

[30]吳建勇， 趙德璋. 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的幾種方法的比較[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010（9）：1386～1389.

[31]王 磊， 肖洪彬， 牛雯穎， 等. 流式細(xì)胞術(shù)對2型糖尿病大鼠紅細(xì)胞凋亡的研究[J]. 中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志， 2015（5）：660～663.

[32]Van-Dilla M. A.， Trujillo T. T.， Mullaney P. F.， et al. Cell microfluorometry：a method for rapid fluorescence measurement[J]. Science， 1969（163）：1213～1214.

[33]覃吉超， 陶得定， 舒 丹， 等. 一種新的細(xì)胞周期分析方法[J]. Chinese Journal of Cancer， 2001， 20（2）：206～210.

[34]Gong J.， Tragano F.， Darzynkiewicz Z.. Staurosporine blocks cell progression through G1 between the cyclin D and cyclin E restriction points[J]. Cancer Res， 1994（54）：3136～3139.

[35]耿慧霞， 王 來， 王 強(qiáng). 流式細(xì)胞儀在生物學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)雜志， 2005（4）：44～45+51.

[36]Tizard J. R.. Veterinary Immunology，an introduction （sixth edition）[M]. Philadelphia：W B Saunders Company， 2000：84～109.

[37]Eli Benjamin， Richard Coico， Geoffrey Sunshine. Immunology（forth edition），a short course[M]. New York：Jorn Wiley & Sons， Inc， 2000.

[38]馬學(xué)恩. 流式細(xì)胞術(shù)及其在動物病理學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2001（4）：1～3.

[39]楊蕾芳， 巴彩鳳. 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠感染附紅細(xì)胞體后Th17細(xì)胞的表達(dá)[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)， 2012（4）：347～350.

[40]屈雪琪， 趙建增， 梁智選， 等. 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同試驗(yàn)條件對豬T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2011（4）：101～104.

[41]黃 瓊， 李 志， 楊杏芬， 等. 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2007（2）：140～146.

[42]金齊力， 姜麗娜， 姚春艷， 等. 流式細(xì)胞術(shù)檢測單核巨噬細(xì)胞吞噬熒光素標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌的方法學(xué)探討[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2008（5）：505～508.

[43]De-Cuyper I. M.， Meinders M.， Van-De-Vijver E.， et al. Anovel flow cytometry-based platelet aggregation assay[J]. Blood， 2013， 121（10）：70～80.

[44]梅金平， 周 欣， 姬文婕， 等. 基于流式細(xì)胞術(shù)的小鼠血小板聚集率檢測方法評價(jià)及川芎嗪的干預(yù)作用[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志， 2015（5）：585～588.

[45]李元堂. 流式細(xì)胞術(shù)在血液系統(tǒng)腫瘤診斷、治療中的應(yīng)用[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)， 2005， 28（2）：93～95.

[46]Raynal P.， Pollard H. B.. Annexin V：the probe of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calcium and phosphoipid2binding proteins[J]. Biochem Biophys Acta， 1996（1197）：63～93.

[47]王 丹， 王慶山， 蔡 姝， 等. 流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用[J]. 中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志， 2007（24）：23～24.

[48]Patel A. M.， Pancoska C.， Mulgaonkar S.， et al. Renal transplantation in patients with pretransplant donorspecific antibodies and negative flow cytometry crossmatches[J]. Am J Transplant， 2007， 7（10）：2371～2377.

[49]Urosevic M.， Conrad C.， Kamarashev J.， et al. CD4+/ CD56+ hematodermic neoplasms bear a plasmacytoid dendritic cellphenotype[J]. Hum Pathol， 2005， 36（9）：1020～1024.