紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）CD8基因的克隆與誘導(dǎo)表達(dá)

黃郁蔥梁秀全蔡雙虎魯義善簡(jiǎn)紀(jì)常吳灶和

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088）

紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）CD8基因的克隆與誘導(dǎo)表達(dá)

黃郁蔥1，2梁秀全1蔡雙虎1，2魯義善1，2簡(jiǎn)紀(jì)常1，2吳灶和2

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088）

探討紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）CD8基因的基本特性。應(yīng)用同源克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)克隆了紅笛鯛CD8α和CD8β基因，并分析了其在不同組織的表達(dá)分布及免疫刺激物誘導(dǎo)后的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，CD8α cDNA序列全長(zhǎng)1 576 bp，編碼225個(gè)氨基酸。紅笛鯛CD8β基因cDNA序列全長(zhǎng)為1 486 bp，編碼210個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，CD8α和CD8β均由信號(hào)肽、免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成。熒光定量PCR（Real time quantitative PCR，qRT-PCR）分析顯示紅笛鯛CD8α和CD8β基因在胸腺表達(dá)量最高，其次為中腎、鰓、腸、皮膚、脾和頭腎。紅笛鯛頭腎淋巴細(xì)胞體外經(jīng)LPS、ConA和PolyI:C刺激8 h后CD8α和CD8β表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.01）。哈維氏弧菌疫苗刺激24 h后鰓、頭腎、脾臟、和腸的表達(dá)量上升。

紅笛鯛；CD8；基因克隆；誘導(dǎo)表達(dá)

在高等脊椎動(dòng)物，根據(jù)表面標(biāo)志分子CD4和CD8分子表達(dá)不同，將成熟T淋巴細(xì)胞分為CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞兩個(gè)亞群，其中CD8+T淋巴細(xì)胞主要為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTL），是機(jī)體參與抗病毒、抗胞內(nèi)微生物感染、抗腫瘤及抗移植排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞［1］。CD8分子是一種以αα同源二聚體或αβ異源二聚體形式存在的膜結(jié)合糖蛋白［2］。在哺乳動(dòng)物中，αβ異源二聚體主要表達(dá)于成熟T淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞［2］，而αα同源二聚體僅表達(dá)于自然殺傷（Naturalkiller，NK）細(xì)胞［3］、γδT細(xì)胞［4］和腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞［5］。通過(guò)mRNA的不同剪接機(jī)制，在血清中尚存在著可溶型CD8α或CD8β鏈（sCD8）［7］，但其功能尚不清楚。CD8α和CD8β鏈均屬于免疫球蛋白超家族成員，由信號(hào)肽、胞外免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）可變區(qū)、近膜端鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成［7］。

CD8分子在TCR介導(dǎo)的抗原肽-MHCI識(shí)別過(guò)程中與MHC I和β2-微球蛋白（β2m）相互作用而發(fā)揮共受體的功能。晶體結(jié)構(gòu)研究表明CD8α通過(guò)A/B β折疊和胞外免疫球蛋白超家族可變區(qū)內(nèi)的互補(bǔ)決定區(qū)與β2微球蛋白及MHC I分子的α2、α3 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行結(jié)合，有助于穩(wěn)定TCR與抗原肽-MHCI復(fù)合物的相互作用［1］。此外，CD8α鏈胞漿區(qū)存在一個(gè)保守的CXC基序，該基序結(jié)合并激活淋巴細(xì)胞特異性酪氨酸蛋白激酶p56lck［8］，繼而磷酸化CD3多肽鏈中的ITAM基序，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的快速活化［9］。CD8β鏈不含有CXC基序，但在T細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程中同樣發(fā)揮重要作用［10］。亦有研究表明其參與細(xì)胞膜表面脂筏的形成［11］。

近年來(lái)，陸續(xù)開展了有關(guān)魚類的T細(xì)胞免疫的相關(guān)研究。2000年，Hansen等［12］在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中報(bào)道了第一個(gè)魚類CD8分子，隨后多種魚類如大西洋鮭（Salmo salar）［13］、鯽魚（Carassius auratus langsdorfii）［14］、舌齒鱸（Dicentrarchus labrax L.）［15］、大西洋庸蝶（Hippoglossus hi-ppoglossus）［16］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［17］和鱖魚（Siniperca chuatsi）［18］的CD8分子先后得到克隆鑒定。研究也發(fā)現(xiàn)了魚類白細(xì)胞具有與哺乳動(dòng)物CTL細(xì)胞相似的細(xì)胞毒功能［19］，如同種異體移植排斥反應(yīng)和殺傷病毒感染的細(xì)胞。但與哺乳動(dòng)物相比，魚類的T細(xì)胞免疫研究仍然處于初始階段，對(duì)于魚類CD8+T細(xì)胞的功能和其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其他T細(xì)胞標(biāo)記物的聯(lián)系仍有待闡明。

紅笛鯛（Lutianus sanguineus）是我國(guó)南方重要的海水養(yǎng)殖魚種，然而近年來(lái)集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，受到病原侵襲導(dǎo)致病害頻繁爆發(fā)，對(duì)其養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)魚病尚缺乏有效的防治手段，闡明魚類的免疫防御機(jī)制對(duì)于魚病防治具有重要的指導(dǎo)意義。然而，到目前為止尚未有紅笛鯛T細(xì)胞表面標(biāo)志基因的報(bào)道。本研究克隆紅笛鯛CD8基因的cDNA全長(zhǎng)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）分析CD8基因在健康紅笛鯛組織中的表達(dá)和哈維氏弧菌疫苗誘導(dǎo)后在紅笛鯛免疫相關(guān)組織中的表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步研究紅笛鯛T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)魚及菌株 實(shí)驗(yàn)用紅笛鯛（體質(zhì)量80-100 g）購(gòu)自湛江某海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱，經(jīng)檢測(cè)無(wú)病蟲害，健康活力好，于水溫25-28℃的水泥池中進(jìn)行養(yǎng)殖，24 h連續(xù)充氧，每天早晚投喂商品飼料各1次，日換水量1/3，試驗(yàn)前暫養(yǎng)1周。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）強(qiáng)毒株分離自患病紅笛鯛并保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 組織樣品采集 將哈維氏弧菌強(qiáng)毒株接種于TSB（2% NaCl）培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)16 h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌液濃度后，加入終濃度為0.3%的福爾馬林，28℃滅活48 h。經(jīng)檢驗(yàn)滅活完全后，6 000 r/min離心20 min去培養(yǎng)基后用無(wú)菌PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）將菌苗濃度調(diào)整為1×109CFU/mL，置2-8℃保存待用。將試驗(yàn)魚分成2組，刺激組每尾魚腹腔注射0.2 mL疫苗，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS。于刺激后的4、8、12、24、48和72 h分別采集鰓、頭腎、脾臟和腸組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集5尾紅笛鯛，投入RNAlater后于-80℃保存?zhèn)溆?，收集的組織主要用于熒光定量PCR分析。另取5 尾健康紅笛鯛，分別取鰓、胸腺、頭腎、肝、脾、腸、中腎、

心臟、腦、皮膚和肌肉組織立即投入RNAlater后于-80℃保存?zhèn)溆?，收集的組織主要用于CD8 cDNA克隆和組織分布分析。

1.1.3 頭腎淋巴細(xì)胞樣品采集 頭腎淋巴細(xì)胞分離參考Xu［17］和Guo［18］的方法稍加改動(dòng)。分別取5尾健康紅笛鯛用MS-222麻醉后，75%酒精短暫浸泡消毒，無(wú)菌條件下取出頭腎，迅速置于RPMI1640（含100 U青霉素、100 μg/mL鏈霉素和0.5%胎牛血清），用無(wú)菌剪刀將其剪成小塊后置于100目的無(wú)菌細(xì)胞篩網(wǎng)上，用無(wú)菌注射器頭輕輕研磨頭腎組織，用RPMI1640沖洗篩網(wǎng)，制備成頭腎細(xì)胞懸液備用。吸取2 mL頭腎細(xì)胞懸液沿管壁小心緩慢地加到34%和51%不連續(xù)密度梯度Percoll分離液界面上。于4℃ 400 r/min離心30 min，小心吸取兩層Percoll細(xì)胞分離液中間層白細(xì)胞，用RPMI1640洗滌2次，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為5.0×105，以每孔接種1 mL接種到24孔板中，25℃培養(yǎng)4 h后去除單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等粘附細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，重新接種到新的24孔板中。試驗(yàn)組每孔分別加入終濃度為10 μg/mL的 LPS、10 μg/mL ConA和50 μg/mL PolyI:C，對(duì)照組加入PBS，每種處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別于4、8、12和24 h取樣。將樣品于4℃ 500 r/min條件下離心10 min去除培養(yǎng)基，加入500 μL TRIzol于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 按Trizol（全式金）說(shuō)明書分別提取紅笛鯛各組織和細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度法檢測(cè)其純度和濃度，確保其OD260/OD280在1.8-2.0。各組織的總RNA按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）說(shuō)明書合成cDNA第一鏈，置-20℃保存待用。另取頭腎的總RNA，按SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa）說(shuō)明書分別合成用于3'與5'RACE的cDNA，置-20℃保存待用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與基因部分序列擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上已有的硬骨魚類CD8α和CD8β核酸的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物F與R（表1），運(yùn)用降落PCR從紅笛鯛頭腎cDNA第一鏈中擴(kuò)增紅笛鯛CD8α和 CD8β基因的部分序列。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃30 s 5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s 5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s 30個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切下目的條帶，使用GeneJET Kit（Thermo fisher scientific）進(jìn)行回收，與pMD-19T Vector連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列

1.2.3 3'RACE和5'RACE擴(kuò)增 根據(jù)獲得的CD8α和CD8β基因部分序列設(shè)計(jì)特異性巢式引物用于3'RACE 和5'RACE（表1）。將3'CD8αF1、3' CD8βF1和5'CD8αR1、5'CD8βR1分別與UPM Mix引物進(jìn)行3' RACE與5'RACE第一輪降落PCR。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，70℃ 2 min 5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min 5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min 20個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min，4℃保存。將第一輪PCR 產(chǎn)物稀釋20倍作為模板，將3'CD8αF2、3'CD8βF2和5'CD8αR2、5'CD8βR2分別與NUP 進(jìn)行第二輪降落PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，65℃30 s，72℃ 2 min 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物回收和測(cè)序步驟同1.2.2。

1.2.4 生物學(xué)信息分析 使用在線Blast程序（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列同源性比對(duì)和相似性分析；使用Genetyx 6.0和protparam（http:// web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）、分子量（Mw）和理論等電點(diǎn)（pI）等；在線軟件SignalP 3.0 Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP）和TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）分別預(yù)測(cè)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；在線程序NetGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）和NetOGlyc（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）預(yù)測(cè)N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn)；運(yùn)用SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域；使用ClustalX 2.0 及MEGA 6.0 軟件以鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自檢數(shù)為1 000。物種CD8分子序列號(hào)，見(jiàn)表2。

表2 不同物種CD8分子GenBank登錄號(hào)

1.2.5 熒光定量PCR和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 將cDNA第一鏈稀釋5倍后用作qRT-PCR的模板，根據(jù)CD8α和CD8β基因ORF設(shè)計(jì)引物reCD8αF、reCD8αR和reCD8βF、reCD8βR（表1），以β-actin為內(nèi)參基因，利用ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)紅笛鯛CD8α和CD8β基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性20 s，60℃退火20 s，60℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2ˉΔΔCt法計(jì)算紅笛鯛CD8α和CD8β基因的相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和Tukey HSD多重比較。

2 結(jié)果

2.1 序列特征分析

紅笛鯛CD8αcDNA全長(zhǎng)為1 576 bp（GenBank登錄號(hào)：KF285563），包含94 bp 5' 非翻譯區(qū)（Untranslated Region，UTR）、804 bp 3' UTR和678 bp ORF。其ORF推導(dǎo)編碼225個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別為24.90 kD和9.44，無(wú)N-糖基化位點(diǎn)。紅笛鯛CD8βcDNA全長(zhǎng)為1 486 bp（GenBank登錄號(hào)：KF285564），包含74 bp 5' UTR、779 bp 3' UTR和633 bp ORF。其ORF 推導(dǎo)編碼210個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別為23.58 kD 和9.81，含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。SignalP 4.1 Server和TMHMM Server V. 2.0預(yù)測(cè)顯示CD8α和CD8β氨基酸序列均屬于I型跨膜蛋白分子，由信號(hào)肽、免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）可變區(qū)、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。

2.2 氨基酸序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

將紅笛鯛CD8α和GenBank已登錄的其他動(dòng)物的CD8α進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。其中紅笛鯛CD8α和舌齒鱸的CD8α同源性最高，達(dá)62.5%，與哺乳動(dòng)物和鳥類的同源性較低，為20.5%-23.0 %。紅笛鯛CD8β和鱖魚的CD8β同源性最高，達(dá)73.0%，與哺乳動(dòng)物和鳥類的同源性較低，為23.9%-28.1%。氨基酸序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，包括紅笛鯛在內(nèi)的魚類CD8α和CD8β的IgSF可變區(qū)和鉸鏈區(qū)分別含有一對(duì)保守的Cys殘基，而且鉸鏈區(qū)富含Thr、Ser和Pro殘基，形成多個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。此外，CD8α和CD8β的胞漿區(qū)均無(wú)p56lck的結(jié)合位點(diǎn)CXC基序，但分別含有魚類中高度保守的RTRRCPHHYKR和LPKKCRH基序（圖1，圖2）。利用MEGA 6.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建CD8氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）顯示，CD8α和 CD8β分別形成兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，在CD8α分支上，紅笛鯛與硬骨魚鱸形目的舌齒鱸聚在一起，表明它們親緣關(guān)系最近。在CD8β分支上，紅笛鯛與鱖魚和斜帶石斑魚聚在一起，表明它們親緣關(guān)系最近。在兩個(gè)分支上紅笛鯛均與鳥類和哺乳類遺傳距離較遠(yuǎn)，這與blastp的結(jié)果一致。

2.3 CD8在健康紅笛鯛組織中的分布

應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CD8α和CD8β在健康紅笛鯛不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平，分析結(jié)果（圖4）顯示，CD8α和CD8β在各組織均有不同程度的表達(dá)，其中CD8α和CD8β均在胸腺的表達(dá)量最高，CD8α在中腎、鰓、腸、皮膚、脾和頭腎組織中表達(dá)量次之，CD8β則在中腎、鰓、腸、皮膚、肌肉和心組織中表達(dá)量次之；其他組織表達(dá)量較低。

圖1 紅笛鯛CD8α與其他脊椎動(dòng)物CD8α氨基酸序列比較

圖2 紅笛鯛CD8β與其他脊椎動(dòng)物CD8β氨基酸序列比較

2.4 淋巴細(xì)胞體外刺激后CD8α和CD8β的表達(dá)模式

應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)了紅笛鯛頭腎淋巴細(xì)胞體外經(jīng)LPS、ConA和PolyI∶C刺激后CD8α和CD8β的表達(dá)變化。結(jié)果（圖5，圖6）顯示，在試驗(yàn)期內(nèi)，LPS處理組的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯上升（P>0.05）。ConA和PolyI:C處理組的CD8α和CD8β的表達(dá)量于刺激后4 h顯著升高（P<0.05），并于8 h達(dá)到最高（P<0.01），然后開始快速下降，于24 h內(nèi)回歸到基礎(chǔ)表達(dá)水平。

2.5 滅活哈氏弧菌刺激紅笛鯛后CD8 mRNA的表達(dá)分析

應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)了哈維氏弧菌疫苗刺激紅笛鯛4、8、12、24、48和72 h后CD8α和CD8β的mRNA在紅笛鯛鰓、頭腎、脾臟和腸的表達(dá)變化。結(jié)果（圖7，圖8）顯示，在哈氏弧菌疫苗刺激4 h后，CD8α和CD8β mRNA表達(dá)量開始輕微上調(diào)表達(dá)，在鰓和腸中于12 h達(dá)到最高（P<0.05），在頭腎和脾臟中的表達(dá)量于24 h達(dá)到最高，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），然后開始緩慢下降，72 h后回落到基礎(chǔ)表達(dá)水平。

3 討論

作為MHC I類限制性T細(xì)胞識(shí)別抗原的輔助受體，CD8分子在T細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。本研究獲得了紅笛鯛CD8α和CD8β基因的cDNA全序列，分別編碼225和210個(gè)氨基酸，與已發(fā)現(xiàn)的其他魚類和哺乳動(dòng)物的CD8結(jié)構(gòu)相類似，均由信號(hào)肽、IgSF可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成。盡管與哺乳動(dòng)物的同源性較低，但仍具有一些高度保守的氨基酸殘基、糖基化位點(diǎn)和功能基序，對(duì)CD8分子的正確折疊和執(zhí)行功能起關(guān)鍵作用［20］。

圖 3 基于NJ 法構(gòu)建的CD8α和CD8β氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 頭腎淋巴細(xì)胞體外經(jīng)LPS、ConA 和PolyI：C刺激后CD8α mRNA的表達(dá)變化

氨基酸序列多重比較顯示，紅笛鯛CD8α和 CD8β的IgSF可變區(qū)均包含一對(duì)保守的半胱氨酸，用以形成結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵［21］。鉸鏈區(qū)同樣存在一對(duì)保守的半胱氨酸殘基，參與同源二聚體（在一對(duì)保守的半胱氨酸殘基形成結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵度［22］，預(yù)示魚類CD8分子與哺乳動(dòng)物的CD8同樣可二聚化形成二聚體。值得注意的是，大部分硬骨魚CD8α的跨膜區(qū)及CD8βDIgSF可變區(qū)均含有額外兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基，然而，對(duì)于它們的功能尚未清楚，有待進(jìn)一步研究加以闡明。此外，紅笛鯛CD8鉸鏈區(qū)富含Thr、Ser和Pro，而且含有多個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)，有助于其保持伸展?fàn)顟B(tài)從而提高與TCR和MHC I的α3結(jié)構(gòu)域結(jié)合能力［21］，增強(qiáng)其輔助受體功能［23］。

跨膜區(qū)和胞漿區(qū)在所有物種中均相對(duì)保守，其中含有較多帶正電荷的氨基酸殘基和一些保守基序［15］。高等哺乳動(dòng)物和鳥類的CD8分子胞漿區(qū)含有CXC基序，該基序通過(guò)形成鋅扣結(jié)構(gòu)結(jié)合絡(luò)氨酸蛋白激酶p56lck［24］，參與T細(xì)胞活化增殖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，但包括紅笛鯛在內(nèi)的硬骨魚中均未發(fā)現(xiàn)，代之為CXH基序。Moore等［13］推測(cè)Cys和His同樣可通過(guò)形成相似的鋅扣結(jié)構(gòu)將p56lck激酶連接到胞漿區(qū)尾部，但Turner等［8］也發(fā)現(xiàn)用Ala殘基替換第二個(gè)Cys殘基后會(huì)降低p56lck激酶與CXC基序的親和力。盡管目前的研究表明表明魚類CD8+T細(xì)胞可發(fā)揮細(xì)胞毒功能［19，25］，但是魚類中p56lck激酶與魚類CD8分子胞漿區(qū)中的保守基序的結(jié)合方式和結(jié)合能力仍未清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)除了CD8β在頭腎和脾臟組織中表達(dá)量較低外，CD8α和CD8β mRNA在其余組織中的表達(dá)模式較相似，二者的表達(dá)量均在胸腺中最高，是其他組織表達(dá)量的10-800倍，與其在大西洋鮭［13］、舌齒鱸［15］、大西洋庸鰈［16］和鱖魚［17］等魚類的研究結(jié)果相似。胸腺是魚類中樞免疫器官，CD8在胸腺中的高表達(dá)再次表明胸腺是T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生、成熟和分化的場(chǎng)所。脾臟和頭腎是魚類重要的外周免疫器官，中腎是魚類的排泄器官，其中的造血組織間同樣含有T淋巴細(xì)胞［26］，研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞散在分布于其中參與系統(tǒng)免疫應(yīng)答［27］。此外，發(fā)現(xiàn)CD8在紅笛鯛皮膚、腸和鰓中等也具有較高的的表達(dá)量，與在大西洋鮭［13］和金銀鯽［14］、舌齒鱸［15］的發(fā)現(xiàn)相一致，可能是由于在黏膜相關(guān)淋巴組織內(nèi)存在一定數(shù)量的CD8陽(yáng)性細(xì)胞［28］，表明CD8分子在局部黏膜免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

LPS是一種經(jīng)典的促B細(xì)胞活化的有絲分裂原，頭腎淋巴細(xì)胞體外經(jīng)LPS刺激后CD8在各時(shí)段的表達(dá)量沒(méi)有改變，與小鼠T淋巴細(xì)胞的研究結(jié)果相同［29］，表明其不能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增殖。經(jīng)ConA和PolyI∶C刺激后CD8均顯著上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)模式與鱖魚的CD8分子的表達(dá)模式相似［18］。而PolyI∶C是一種雙鏈RNA病毒類似物，可激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。ConA通過(guò)有絲分裂原受體與T淋巴細(xì)胞結(jié)合刺激其增殖，研究表明河豚的CD8 陽(yáng)性細(xì)胞在ConA和PHA刺激下顯著增殖［30］，此外還可刺激人外周血單核細(xì)胞中CD8持續(xù)上調(diào)表達(dá)［31］。因此，推測(cè)魚類的CD8陽(yáng)性細(xì)胞具有哺乳類CD8陽(yáng)性細(xì)胞部分相似的特性。

圖6 頭腎淋巴細(xì)胞體外經(jīng)LPS、ConA和PolyI：C刺激后CD8β mRNA的表達(dá)變化

圖7 哈維氏弧菌免疫后CD8α mRNA在鰓、頭腎、脾和腸組織中的表達(dá)水平

圖8 哈維氏弧菌免疫后CD8β mRNA在鰓、頭腎、脾和腸組織中的表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)中哈維氏弧菌疫苗免疫12 h后CD8α和CD8β在頭腎、脾臟、鰓和腸中均有一定程度的上調(diào)表達(dá)，與耶爾森氏菌疫苗免疫虹鱒后的研究結(jié)果相似［32］。在牙鲆感染愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）和病毒性出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV）后也出現(xiàn)CD8出現(xiàn)表達(dá)水平顯著升高的現(xiàn)象［33］。CD8是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的標(biāo)記分子，病原感染后表達(dá)量升高表明引起CD8陽(yáng)性細(xì)胞活化增殖參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，但它們?cè)诿庖叻磻?yīng)過(guò)程中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。此外，本研究中紅笛鯛的CD8α和CD8β mRNA在健康狀態(tài)及感染后組織表達(dá)模式非常相似，預(yù)示組織中的CD8αβ可能以異二聚體形式存在相同的細(xì)胞中表達(dá)，Kato等［33］發(fā)現(xiàn)牙鲆CD8α和CD8βmRNA存在于脾和頭腎中的相同細(xì)胞簇中，Takizawa等［34］使用單克隆抗體鑒定虹鱒CD8α+細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD8β mRNA，該兩項(xiàng)研究提供了CD8αβ異二聚體陽(yáng)性細(xì)胞存在的間接證據(jù)。本研究克隆了CD8α和CD8β基因，為進(jìn)一步制備單克隆抗體、分選CD8+T細(xì)胞以及細(xì)胞毒性T淋巴介導(dǎo)的的免疫應(yīng)答研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得了紅笛鯛CD8α和CD8β基因，均由信號(hào)肽、免疫球蛋白超家族可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成，健康紅笛鯛CD8α和CD8β基因在胸腺中表達(dá)量最高，其次為中腎、鰓、皮膚、脾、頭腎和腸。紅笛鯛頭腎淋巴細(xì)胞CD8α和CD8β體外經(jīng)LPS、ConA和PolyI:C刺激后表達(dá)量上調(diào)。哈維氏弧菌疫苗免疫24 h后鰓、頭腎、脾臟、和腸的CD8α和CD8β表達(dá)量上升。

［1］ 龔非力. 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］. 第3版. 北京：科學(xué)出版社, 2009： 63-79.

［2］Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition［J］. Annual Review of Immunolgy, 2002, 20（1）：197-216.

［3］Detotero D, Tazzari PL, DiSanto JP, et al. Heterogeneous immunophenotype of granular lymphocyte expansions：differential expression of the CD8α and CD8β chains［J］. Blood, 1992, 80（7）：1765-1773.

［4］Poussier P, Julius M. Thymus independent T cell development and selection in the intestinal epithelium［J］. Annual Review of Immunolgy, 1994, 12（1）：521-553.

［5］Reimann J, Rudolphi A. Co-expression of CD8α in CD4+ T cell receptor αβ+ T cells migrating into the murine small intestine epithelial layer［J］. European Journal of Immunology, 1995, 25（6）：1580-1608.

［6］Giblin P, Ledbetter JA, Kavathas P. A secreted form of the human lymphocyte cell surface molecule CD8 arises from alternative splicing［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1989, 86（3）：998-1002.

［7］Frazer JK, Capra JD. Fundamental immunology［M］. 4th ed. New York：Lippincott-Raven, 1999：37-74.

［8］Turner JM, Brodsky MH, Irving BA, et al. Interaction of the unique N-terminal region of tyrosine kinase p56lck with cytoplasmic domains of CD4 and CD8 is mediated by cysteine motifs［J］. Cell, 1990, 60（5）：755-765.

［9］Barber EK, Dasgupta JD, Schlossman SF, et al. The CD4 and CD8 antigens are coupled to a protein-tyrosine kinase（p56Lck）that phosphorylates the CD3 complex［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86（9）：3277-3281.

［10］Nakayama K, Nakayama K, Negishi I, et al. Requirement for CD8β chain in positive selection of CD8-lineage T cells［J］. Science, 1994, 263（5150）：1131-1133.

［11］Arcaro A, Grégoire C, Boucheron N, et al. Essential role of CD8 palmitoylation in CD8 coreceptor function［J］. The Journal of Immunology, 2000, 165（4）：2068-2076.

［12］Hansen JD, Strassburger P. Description of an ectothermic TCR coreceptor, CD8α, in rainbow trout［J］. The Journal of Immunology, 2000, 164（6）：3132-3139.

［13］Moore LJ, Somamoto T, Lie KK, et al. Characterisation of salmon and trout CD8α and CD8β［J］. Molecular Immunology, 2005, 42（10）：1225-1234.

［14］Somamoto T, Yoshiura Y, Nakanishi T, et al. Molecular cloning and characterization of two types of CD8α from ginbuna crucian carp, Carassius auratus langsdorfii［J］. Developmental &Comparative Immunology, 2005, 29（8）：693-702.

［15］Buonocore F, Randelli E, Bird S, et al. The CD8α from sea bass（Dicentrarchus labrax L.）：Cloning, expression and 3D modelling［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2006, 20（4）：637-646.

［16］Patel S, Overg?rd AC, Nerland AH. CD8α and CD8β in Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus：cloning, characterization and gene expression during viral and bacterial infection［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2008, 5（5）：570-80.

［17］Xu SW, Wu JY, Hu KS, et al. Molecular cloning and expression of orange-spotted grouper（Epinephelus coioides）CD8α and CD8β genes［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2011, 30（2）：600-608.

［18］Guo Z, Wang GL, Fu JP, et al. Characterization and expression of Cd8 molecules in mandarin fish Siniperca chuatsi［J］. Journal of Fish Biology, 2013, 82（1）：189-205.

［19］Fischer U, Utke K, Somamoto T, et al. Cytotoxic activities of fish leucocytes［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2006, 20（2）：209-226.

［20］Parnes JR. Molecular biology and function of CD4 and CD8［J］. Advances in Immunology, 1989, 44（4）：265-311.

［21］Leahy DJ, Axel R, Hendrickson WA. Crystal structure of a soluble form of the human T cell coreceptor CD8 at 2. 6 A resolution［J］. Cell, 1992, 68（6）：1145-1162.

［22］Littman DR, Thomas Y, Maddon PJ, et al. The isolation and sequence of the gene encoding T8：a molucule defining functional classes of T lymphocytes［J］. Cell, 1985, 40（2）：237-246.

［23］Wong JS, Wang X, Witte T, et al. Stalk regionof β chain enhances the coreceptor function of CD8［J］. The Journal of Immunology, 2003, 171（2）：867-74.

［24］ Kim PW, Sun ZY, Blacklow SC. A zinc clasp structure tethers lck to T cell coreceptors CD4 and CD8［J］. Science, 2003, 301（5640）：1725-1728.

［25］Chang YT, Kai YH, Chi SC, et al. Cytotoxic CD8α+ leucocytes have heterogeneous features in antigen recognition and class I MHC restriction in grouper［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2011, 30（6）：1283-1293.

［26］Katakura F, Yamaguchi T, Yoshida M, et al. Demonstration of T cell and macrophage progenitors in carp（Cyprinus carpio）kidney hematopoietic tissues. Development of clonal assay system for carp hematopoietic cells［J］. Developmental & Comparative Immunology, 2010, 34（6）：685-689.

［27］李珠, 吳灶和, 簡(jiǎn)紀(jì)常, 等. 紅笛鯛脾臟、頭腎和胸腺中IgM+細(xì)胞與ANAE+T細(xì)胞的分布［J］. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27（3）：55-59.

［28］ Nu?ez Ortiz N, Gerdol M, Stocchi V, et al. T cell transcripts and T cell activities in the gills of the teleost fish sea bass（Dicentrarchus labrax）［J］. Developmental & Comparative Immunology, 2014, 47（2）：309-318.

［29］ Milner EC, Rudbach JA, Voneschen KB. Cellular responses to bacteriallipopolysaccharide：T cells recognize LPS determinants［J］. Scandinavian Journal of Immunology, 1983, 18（1）：21-28.

［30］ Araki K, Suetake H, Kikuchi K, Suzuki Y. Characterization and expression analysis of CD3ε and CD3γδ in fugu, Takifugu rubripes［J］. Immunogenetics, 2005, 57（1-2）：158-163.

［31］ Jason J, Inge KL. Mitogen-induced modulation of CD3, CD4, and CD8（1）［J］. Human Immunology, 2000, 61（3）：202-211.

［32］ Raida MK, Buchmann K. Bath vaccination of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss Walbaum）against Yersinia ruckeri：effects of temperature on protection and gene expression［J］. Vaccine, 2008, 26（8）：1050-1062.

［33］ Kato G, Goto K, Akune I, et al. CD4 and CD8 homologues in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus：Differences in the expressions and localizations of CD4-1, CD4-2, CD8α and CD8β［J］. Developmental & Comparative Immunology, 2013, 39（3）：293-301.

［34］ Takizawa F, Dijkstra JM, Kotterba P, et al. The expression of CD8α discriminates distinct T cell subsets in teleost fish［J］. Developmental & Comparative Immunology, 2011, 35（7）：752-763.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Molecular Cloning and Induced Expression Analysis of CD8 Gene from Humphead Snapper

HUANG Yu-cong1，2LIANG Xiu-quan1CAI Shuang-hu1，2LU Yi-shan1，2JIAN Ji-chang1，2WU Zao-he2
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088）

This work aims to characterize CD8 gene of humphead snapper，Lutjanus sanguineus. The full length cDNA sequences of CD8α and CD8β genes were cloned by homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends（RACE）from humphead snapper，and their tissue distribution and expression pattern after induction with immunostimulants were also analyzed by real time quantitative PCR（qRT-PCR）. The CD8α’s cDNA consisted of 1 576 bp encoding 225 amino acids，and the CD8β’s cDNA consisted of 1 486 bp encoding 210 amino acids. The predicted CD8α and CD8β proteins were similar in structure，both contained a signal peptide，immunoglobulin superfamily variable domain，hinge region，transmembrane domain and cytoplasmic tail. The qRT-PCR analysis showed that the highest level of CD8α and CD8β mRNA expression was found in thymus，followed by kidney，gill，intesine，skin，spleen，and head kidney. Furthermore，the mRNA levels of CD8α and CD8β in head kidney leucocytes was significantly up-regulated after 8 h treated with the stimulants lipopolysaccharide（LPS），concanavalin A（ConA），and polyinosinic-polycytidylic acid（PolyI∶C），respectively（P < 0.01）. And their expression levels in gill，anterior kidney，spleen，and intesine also increased at 24 h after stimulated with formalin-inactivated Vibrio harveyi.

Lutjanus sanguineus；CD8；gene cloning；induced expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0095

2017-02-16

廣東省自然科學(xué)基金（2016A030313748），廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)（GD2012-B01-004），大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（CXXL2014020），廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（GLMBT- 201404）

黃郁蔥，男，博士，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制；E-mail：hyczjou@163.com

簡(jiǎn)紀(jì)常，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制；E-mail：jianjc@163.com