• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    抗腫瘤多肽9R-P201誘導(dǎo)下的肝癌HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析

    2017-07-12 18:05:57劉文榮丁若凡張一鳴李宇鵬李玲郭志云
    生物技術(shù)通報 2017年7期
    關(guān)鍵詞:多肽位點測序

    劉文榮丁若凡張一鳴李宇鵬李玲郭志云

    (1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610031;2. 成都市第三人民醫(yī)院病理科,成都 610031)

    抗腫瘤多肽9R-P201誘導(dǎo)下的肝癌HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析

    劉文榮1丁若凡1張一鳴1李宇鵬1李玲2郭志云1

    (1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610031;2. 成都市第三人民醫(yī)院病理科,成都 610031)

    旨在探索多肽9R-P201處理肝癌HepG2細胞后基因融合、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)突變、可變剪接等事件,并分析差異表達基因所參與的生物學(xué)進程與信號通路,以期解析多肽9R-P201在轉(zhuǎn)錄組水平對肝癌細胞的調(diào)控。通過轉(zhuǎn)錄組測序檢測9R-P201處理肝癌HepG2細胞前后基因差異表達情況,tophat-fusion軟件檢測基因融合,SAMTOOLS軟件檢測SNP位點,rMATS軟件鑒定可變剪接,使用基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析方法對差異表達基因進行功能富集分析。結(jié)果共檢測到可變剪接事件276個、SNP位點5 557個、基因融合事件45個;同時共得到顯著差異表達基因 403個,其中上調(diào)269個而下調(diào)134個,基因的功能富集分析結(jié)果顯示差異表達基因顯著富集細胞生長、遷移等腫瘤相關(guān)生物進程,并參與多條與癌癥相關(guān)的信號通路。研究表明在9R-P201誘導(dǎo)HepG2細胞后,導(dǎo)致表達差異基因顯著與腫瘤生物學(xué)進程和通路相關(guān),并發(fā)生了大量可變剪接、SNP突變、基因融合等事件,這暗示著該多肽有望作為后續(xù)肝癌介入治療潛在藥物分子。

    9R-P201;肝細胞癌;轉(zhuǎn)錄組測序;基因

    在全世界范圍內(nèi),肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最為常見的惡性腫瘤之一,死亡率高居所有腫瘤第二位[1]。目前除了肝移植、手術(shù)以及放化療等治療手段外,分子靶向藥物在治療肝細胞癌方面也取得了許多重要的進展[2]。目前靶向肝細胞癌藥物主要包括化學(xué)藥物和多肽藥物,其中索拉菲尼、舒尼替尼、瓦他拉尼等分子靶向化學(xué)藥物已在臨床上應(yīng)用[3]。除此之外,靶向肝細胞癌的多肽藥物的研究也取得明顯進展,多肽藥物是由人工合成的或經(jīng)分離純化得到的活性多肽,先前研究發(fā)現(xiàn)一些小分子多肽在抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用。例如,蛋氨酸腦啡肽(Methionine enkephalin,MENK)是具有增強體液免疫和提高細胞殺傷作用的內(nèi)源性多肽,研究表明MENK通過精確調(diào)控樹狀細胞的阿片類藥物受體介導(dǎo)的功能來發(fā)揮抗腫瘤的活性[4]。研究證實從家蠶幼蟲中分離得到的抗菌肽CecropinXJ 能抑制肝癌細胞的生長并誘導(dǎo)凋亡,這暗示著CecropinXJ 或許可作為抗肝癌的多肽藥物[5]。

    本實驗室前期通過噬菌體隨機12肽庫篩選得到了一個多肽9R-P201,實驗證實9R-P201可顯著抑制肝癌HepG2細胞的存活、增殖和遷移并誘導(dǎo)凋亡[6,7]。為了探尋多肽9R-P201在轉(zhuǎn)錄組水平抑制肝細胞癌的形成發(fā)展的機理,本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)?R-P201處理HepG2細胞前后的基因表達譜進行分析,篩選出了一系列差異表達基因,并證明其生物學(xué)功能。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人肝癌細胞HepG2細胞株來自于四川大學(xué)生命學(xué)院,由本實驗室保管;9R-P201購自上海強耀生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素購自Hyclone公司;胎牛血清購自Biowest公司;Trizol Regent購自Invitrogen公司;轉(zhuǎn)錄組測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞用含有10% 胎牛血清(Biowest),100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素(Hyclone)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco),并置于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細胞3.0×105個接種于6孔板中,培養(yǎng)過夜至細胞融合度達到80 %左右,用80 μg/mL的9R-P201(上海強耀生物)作用于HepG2細胞,處理24 h后,收集細胞用于后續(xù)的RNA提取。

    1.2.2 RNA提取及質(zhì)量檢測 收集好的9R-P201處理和未處理的HepG2細胞用Trizol試劑(Invitrogen)按試劑說明書提取細胞總RNA。1 %瓊脂糖凝膠電泳和酶標儀(Biotech)鑒定RNA的純度、濃度及完整性,合格的總RNA保存于-80℃冰箱待用。

    1.2.3 RNA文庫構(gòu)建、測序 RNA檢測合格后,用帶有Oligo(dT)的磁珠進行富集并隨機打斷,以短片段RNA為模板,用六堿基隨機引物(random hexamers)合成一鏈cDNA,然后加入緩沖液、dNTPs、RNase和DNA polymerase I合成二鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭,最后進行PCR富集得到鏈特異性cDNA文庫,使用Illumina HiSeq 4000測序儀進行文庫測序。

    1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的處理、比對和組裝 測序原始測序數(shù)據(jù)通過去除帶接頭和低質(zhì)量的reads后獲得高質(zhì)量的clean reads。使用Tophat2軟件將clean reads比對到hg19參考基因組上,用Cufflinks軟件按照hg19參考基因組進行組裝[8]。

    1.2.5 可變剪接鑒定、基因融合事件鑒定和SNP位點分析 使用rMATS軟件進行可變剪接的鑒定,在本次轉(zhuǎn)錄組測序分析中我們主要對常見的5種可變剪接類型進行統(tǒng)計。使用tophat-fusion軟件來鑒定基因融合,最后使用Circos可視化工具來繪制基因融合示意圖[9]。將每個樣品的測序結(jié)果與參考基因組相比,使用SAMTOOLS軟件檢測SNP位點,并使用ANNOVAR工具對SNP位點進行注釋[10]。

    1.2.6 差異表達基因及功能富集分析 采用Audic S算法進行差異表達分析,將錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate,F(xiàn)DR)校正后的q< 0.05且差異倍數(shù)|log2FC|≥1的視為差異表達基因,并對篩選得到的差異表達基因進行聚類分析。利用GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達的基因進行GO與信號通路富集分析,以q < 0.05為顯著性閾值[11,12]。

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與差異分析基因分析

    轉(zhuǎn)錄組測序得到對照組和處理組總的reads數(shù)分別有46 698 580和39 332 045條,過濾得到clean reads數(shù)所占的比例分別為99.45%和97.46%。本次轉(zhuǎn)錄組測序共檢測到18 152個基因,按照差異表達篩選標準得到差異表達基因 403個,其中上調(diào)269個下調(diào)134個,我們對篩選得到的差異表達基因分析表明9R-P201處理后基因整體呈上調(diào)趨勢(圖1)。

    2.2 可變剪接與基因融合事件鑒定

    對常見的5種可變剪接類型的數(shù)量進行了統(tǒng)計,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本次轉(zhuǎn)錄組測序中一共檢測到276個可變剪接,其中外顯子跳躍(Exon skipping,ES)最多有126個而內(nèi)含子保留(Intron Retention,RI)最少有12個,此外3'端可變剪接(Alternative 3' splice site,A3SS)有54個、5'端可變剪接(Alternative 5' splice site,A5SS)有60個、互斥外顯子(Mutually exclusive exon,MXE)有24個(圖2-A)。

    異常的融合基因可以引起惡性血液疾病以及腫瘤,為此進行了基因融合分析。結(jié)果共鑒定得到45個基因融合,發(fā)現(xiàn)基因融合事件主要發(fā)生在11號、12號和19號染色體上(圖2-B)。在這45個基因融合中,F(xiàn)TH1、GAPDH、KRT7等基因與其它基因發(fā)生融合的頻率比較高(表1)。

    2.3 SNP分析

    通過在對照組和處理組進行SNP分析發(fā)現(xiàn)在對照組和處理組中分別得到SNP位點2 180個和3 377個,其中對照組的2 180個SNP包括816個非同義突變SNP(Nonsynonymous SNP)和1 364個同義突變SNP(Synonymous SNP),處理組的3 377個SNP包括1 249個非同義突變SNP(Nonsynonymous SNP)和2 128個同義突變SNP(Synonymous SNP);同義突變SNP和非同義突變SNP中都包括6種類型SNP突變,結(jié)果(圖2-C)發(fā)現(xiàn)C/T的突變頻率最高而A/T的突變頻率最低。

    圖1 差異表達基因分析

    2.4 差異表達基因功能分析

    通過GO和KEGG富集分析對403個差異表達基因進行功能注釋,以q < 0.05為顯著性閾值。GO富集分析一共富集上34條GO term,包括生物學(xué)過程(BP)18條、細胞成分(CC)8條以及分子功能(MF)8條,其中富集上與腫瘤相關(guān)的GO term有細胞生長(q = 5.05E-08)、細胞移動(q = 8.19 E-07)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(q = 9.91 E-06)等(圖3-A)。KEGG信號通路富集分析結(jié)果(圖3-B)表明,差異表達基因顯著地富集上腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)(q = 4.66 E-08)、細胞因子受體相互作用(q = 3.84 E-06)、細胞間隙連接(q = 3.40E-05)等信號通路。

    表1 基因融合事件統(tǒng)計

    3 討論

    本次轉(zhuǎn)錄組測序篩選得到顯著性差異表達基因有403個,其中上調(diào)的有269個而下調(diào)的有134個。GO和KEGG分析結(jié)果表明差異表達基因顯著參與了與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)進程和信號通路。對5種主要的可變剪接類型進行統(tǒng)計,共得到可變剪接位點276個。本研究中一共得到SNP位點5 557個。在SNP位點中,非同義突變SNP位點有2 065個而同義突變SNP位點有3 492個,同義突變所占的比例在70%左右而非同義突變占30%左右,這與文獻報道的結(jié)果一致[13]。同時在SNP突變類型中,C/T和A/G突變的頻率最高,這可能是因為在人類基因組中存在大量的CpG島,同時CpG島中的C常常是甲基化的并容易發(fā)生脫氨基而轉(zhuǎn)變?yōu)門[14]。另外,我們這些獲取的SNP位點還存在一定的假陽性,如肝細胞癌HepG2細胞系經(jīng)過長時間的培養(yǎng),其染色體經(jīng)常存在非整數(shù)倍的染色體變化并且包含如刪除和復(fù)制等的染色體改變,這些染色體的變化會直接影響SNP的檢測結(jié)果[15]。由于RNA-seq檢測的RNA在進行編輯的過程中也會導(dǎo)致序列變異從而可能被錯誤地注釋為SNP,因此一些檢測到的序列變異有可能是RNA編輯位點,而不是真正的SNP[16,17]。此外,由于無法保證對照組與處理組RNA樣本的完全一致,多肽9R-P201處理后導(dǎo)致的SNP中還會存在由于對照組與處理組RNA樣本不一致導(dǎo)致的SNP假陽性。對基因融合進行鑒定,共得到45個基因融合位點,其中FTH1基因與其它基因發(fā)生融合的次數(shù)有17次;研究發(fā)現(xiàn)FTH1基因在離子儲存和轉(zhuǎn)運起重要作用并調(diào)控細胞內(nèi)離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)[18]。

    綜上所述,這些顯著差異表達的基因可能在多肽9R-P201激活的生物學(xué)功能和信號通路中起著重要的功能。同時可變剪接、SNP位點、基因融合等基因組結(jié)構(gòu)的改變也暗示多肽9R-P201在這些事件上對肝癌HepG2細胞的調(diào)控影響。當然,9R-P201對于肝癌細胞的調(diào)控不僅局限于基因來發(fā)揮作用,通過發(fā)現(xiàn)更多的9R-P201下游調(diào)控因子以及信號通路將為基于9R-P201多肽為基礎(chǔ)的藥物開發(fā)將提供更多的支撐。

    圖2 可變剪接、基因融合、SNP分析結(jié)果

    4 結(jié)論

    在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中涉及多個與癌癥相關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路的改變。本研究分析了肝癌HepG2細胞在9R-P201作用下基因差異表達情況、可變剪接、SNP位點和基因融合等。共得到可變剪接位點276個、SNP位點5 557個及基因融合位點45個。此外,還得到顯著差異表達的基因 403個,其中上調(diào)269個,下調(diào)134個?;蚬δ茏⑨尳Y(jié)果表明差異表達基因富集上多個與腫瘤密切相關(guān)的生物學(xué)進程和信號通路,預(yù)示這些基因在9R-P201對肝癌HepG2細胞的調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用。

    [1]Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide:sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer, 2015, 136(5):E359-386.

    [2]Brito AF, Abrantes AM, Tralh?o JG, et al. Targeting hepatocellular carcinoma:what did we discover so far?[J]. Oncology Reviews, 2016, 10(2):302.

    [3]Deng GL, Zeng S, Shen H. Chemotherapy and target therapy for hepatocellular carcinoma:New advances and challenges[J]. World Journal of Hepatology, 2015, 7(5):787-798.

    [4]Meng Y, Gao X, Chen W, et al. Methionine enkephalin(MENK)mounts antitumor effect via regulating dendritic cells(DCs)[J]. International Immunopharmacology, 2017, 44:61-71.

    [5]Xia L, Wu Y, Ma JI, et al. The antibacterial peptide from Bombyxmori cecropinXJ induced growth arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Oncology Letters, 2016, 12(1):57-62.

    [6]Cui J, Huang J, Guo T, et al. Expression and selection of human foxm1c binding peptides and yheir inhibitions on MCF7 cancer cells[J]. Int J Pept Res Ther, 2014, 20(4):447-456.

    [7]Bi Z, Liu W, D ing R, et al. A novel peptide, 9R-P201, strongly inhibits the viability, proliferation and migration of liver cancer HepG2 cells and induces apoptosis by down-regulation of FoxM1 expression[J]. Eur J Pharmacol, 2017, 796:175-189.

    [8]Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq e xperiments with TopHat and Cufflinks[J]. Nature Protocols, 2012, 7(3):562-578.

    [9]Kim D, Salzberg SL. TopHat-Fusion:an algorithm for discovery of novel fusion transcripts[J]. Genome Biol, 2011, 12(8):R72.

    [10]Li HD, Menon R, Omenn GS, et al. The emerging era of genomic data integration for analyzing splice isoform function[J]. Trends in Gene tics:TIG, 2014, 30(8):340-347.

    [11]Thomas PD, Mi H, Lewis S. Ontology annotation:mapping genomic regions to biological function[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2007, 11(1):4-11.

    [12]Kanehi sa M, Araki M, Goto S, et al. KEGG for linking genomes to life and the environment[J]. Nucleic Acids Res, 2008, 36:D480-484.

    [13] Koberle B, Koch B, Fischer BM, et al. Single nucleotide polymorphisms i n DNA repair genes and putative cancer risk[J]. Archives of Toxicology, 2016, 90(10):2369-2388.

    [14]Shastry BS. SNPs:impact on gene function and phenotype[J]. Methods in Molecular Biology, 2009, 578:3-22.

    [15]Chen J, Driguneswar P, Shravan K, et al. Selecting c ell lines for SNP human identification assay development[J]. Atlas Journal of Biotechnology, 2011, 1(1):21-26, 2011.

    [16]Gommans WM, Tatalias NE, Sie CP, et al. Screening of human SNP database identifies recoding sites of A-to-I RNA editing[J]. RNA, 2008, 14(10):2074-2085.

    [17]Eisenberg E, Adamsky K, Cohen L, et al. Identification of RNA editing sites in the SNP database[J]. Nucleic Acids Research, 2005, 33(14):4612-4617.

    [18]Guo J, Xu N, Yao Y, et al. Efficient expression of rec ombinant human heavy chain ferritin(FTH1)with modified peptides[J]. Protein Expression and Purification, 2016, 131:101-108.

    圖3 差異表達基因功能富集分析

    (責任編輯 李楠)

    Transcriptome Sequencing Analysis of Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cells Induced by Antitumor Peptide 9R-P201

    LIU Wen-rong1DING Ruo-fan1ZHANG Yi-ming1LI Yu-peng1LI Ling2GUO Zhi-yun1
    (1. School of Life Science and Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu 610031;2. Department of Pathology,the Third People’s Hospital of Chengdu,Chengdu 610031)

    This wok aims to elucidate the regulation of 9R-P201 on hepatoma cells(HepG2)at transcriptome level by investigating the gene fusion,SNP(Single Nucleotide Polymorphism)mutation,alternative splicing and other events after 9R-P201 treating HepG2,and analyzing the biological processes and signaling pathways involved by differentially expressed genes. The expression differences of the genes before and after the 9R-P201 treating HepG2 cell line were detected by transcriptome sequencing. Meanwhile,gene fusion,SNPs,and alternative splicing were identified by tophat-fusion,SAMTOOLS software,and rMATS respectively. Functional enrichment analysis of differentially expressed genes were performed by GO(Gene Ontology)and KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). As results,276 alternative splicing events,5 557 SNP sites,and 45 gene fusion events were detected in the transcriptome sequencing. In addition,403 differentially expressed genes including 269 up-regulated and 134 down-regulated were detected. Gene GO and KEGG enrichment analysis showed that differentially expressed genes were significantly involved in the biological processes of cell growth,locomotion,as well as a number of cancer-related signaling pathways. In conclusion,the study revealed that the differentially expressed genes resulted from 9R-P201 treating HepG2 were significantly correlated with the biological processes and signaling pathways related to cancer and hepatocellular carcinoma HepG2 cell line,and a large number of alternative splicing events,SNP mutations,gene fusion events after 9R-P201 inducement occurred,suggesting this peptide may be used as a potential drug for subsequent hepatocellular carcinoma interventional therapy.

    9R-P201;hepatocellular carcinoma;transcriptome sequencing;gene

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0053

    2017-01-26

    中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(2682016YXZT04),國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目(201610613066)

    劉文榮,男,碩士研究生,研究方向:非編碼RNA結(jié)構(gòu)與功能;E-mail:liuzimu1992@gmail.com

    郭志云,男,副教授,研究方向:生物信息學(xué);E-mail:zhiyunguo@gmail.com

    猜你喜歡
    多肽位點測序
    杰 Sir 帶你認識宏基因二代測序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    鎳基單晶高溫合金多組元置換的第一性原理研究
    上海金屬(2021年6期)2021-12-02 10:47:20
    CLOCK基因rs4580704多態(tài)性位點與2型糖尿病和睡眠質(zhì)量的相關(guān)性
    二代測序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    二項式通項公式在遺傳學(xué)計算中的運用*
    高多肽含量苦瓜新品種“多肽3號”的選育
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    胎盤多肽超劑量應(yīng)用致嚴重不良事件1例
    基因捕獲測序診斷血癌
    徐寒梅:創(chuàng)新多肽藥物研究與開發(fā)
    精华霜和精华液先用哪个| 日日摸夜夜添夜夜爱| 蜜臀久久99精品久久宅男| av在线蜜桃| av福利片在线观看| 国产精品国产高清国产av| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲性久久影院| 久久久久久久久久成人| 尾随美女入室| 18+在线观看网站| 成人一区二区视频在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲图色成人| 国产精品蜜桃在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品久久久噜噜| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产精品合色在线| 成年版毛片免费区| 在线观看66精品国产| h日本视频在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 国产免费一级a男人的天堂| 中文天堂在线官网| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 久久人妻av系列| 午夜亚洲福利在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久久久久久久大av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲国产精品国产精品| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产淫语在线视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 中文字幕av在线有码专区| 久久久欧美国产精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 小说图片视频综合网站| 国产精品久久久久久久电影| 久久精品91蜜桃| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产 一区精品| 亚洲综合色惰| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品日韩av在线免费观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产精品一区二区性色av| 永久免费av网站大全| 边亲边吃奶的免费视频| 精华霜和精华液先用哪个| 免费电影在线观看免费观看| 高清av免费在线| av视频在线观看入口| 免费观看的影片在线观看| 99久国产av精品国产电影| 麻豆成人午夜福利视频| 久久久久性生活片| 99热6这里只有精品| 老司机福利观看| 一级爰片在线观看| 一级爰片在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲色图av天堂| 国产极品精品免费视频能看的| 三级国产精品欧美在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲乱码一区二区免费版| 草草在线视频免费看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品女同一区二区软件| 日韩av在线大香蕉| 午夜免费激情av| 最近的中文字幕免费完整| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 欧美三级亚洲精品| 久久久午夜欧美精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 热99在线观看视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 最近中文字幕高清免费大全6| 日本一二三区视频观看| 麻豆成人午夜福利视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 伦精品一区二区三区| 老司机影院毛片| 日韩人妻高清精品专区| 热99在线观看视频| 国产av不卡久久| 综合色av麻豆| 国产黄色小视频在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 99在线视频只有这里精品首页| or卡值多少钱| 亚洲av成人av| 久久99热这里只频精品6学生 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 啦啦啦韩国在线观看视频| 搞女人的毛片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| av播播在线观看一区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 性色avwww在线观看| 三级国产精品片| 久久精品国产亚洲av天美| 在线播放无遮挡| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品色激情综合| 超碰av人人做人人爽久久| 国产在视频线精品| 国产单亲对白刺激| 亚洲精品一区蜜桃| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美成人午夜免费资源| 特大巨黑吊av在线直播| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品.久久久| 身体一侧抽搐| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久成人免费电影| 欧美性感艳星| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲av成人精品一二三区| 草草在线视频免费看| 国产黄a三级三级三级人| 日本免费a在线| 简卡轻食公司| 直男gayav资源| 97超碰精品成人国产| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品亚洲一区二区| av免费在线看不卡| 日本av手机在线免费观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 老女人水多毛片| 少妇高潮的动态图| 波多野结衣高清无吗| 亚洲国产精品专区欧美| 观看美女的网站| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲av不卡在线观看| 人人妻人人看人人澡| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 最近视频中文字幕2019在线8| 人妻少妇偷人精品九色| 国产在线一区二区三区精 | 中文天堂在线官网| 亚洲精品乱久久久久久| 超碰av人人做人人爽久久| 老司机影院成人| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲在久久综合| 国产av在哪里看| 精品午夜福利在线看| 天天躁日日操中文字幕| 婷婷色av中文字幕| 看片在线看免费视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲美女视频黄频| 国产黄色小视频在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲av二区三区四区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产亚洲91精品色在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲人成网站在线播| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲伊人久久精品综合 | 欧美成人免费av一区二区三区| 国产在线男女| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产精品伦人一区二区| 免费人成在线观看视频色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产一区二区在线观看日韩| 观看美女的网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 真实男女啪啪啪动态图| 国产高清不卡午夜福利| 国产 一区精品| 青春草亚洲视频在线观看| 国产美女午夜福利| 国产一区有黄有色的免费视频 | 特大巨黑吊av在线直播| 国产午夜精品论理片| 久久久午夜欧美精品| 久久久久久久久久黄片| 色播亚洲综合网| 精品久久久久久成人av| 亚洲欧美成人精品一区二区| av.在线天堂| 国产 一区精品| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品一区www在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费无遮挡裸体视频| av在线观看视频网站免费| 七月丁香在线播放| 亚洲av熟女| 国产精品伦人一区二区| 中国美白少妇内射xxxbb| av在线蜜桃| 免费电影在线观看免费观看| 丝袜美腿在线中文| 中文字幕亚洲精品专区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲美女视频黄频| 嫩草影院入口| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 狠狠狠狠99中文字幕| 久热久热在线精品观看| 国产亚洲精品av在线| 午夜福利在线在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 热99re8久久精品国产| 97超碰精品成人国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 超碰av人人做人人爽久久| 国产视频内射| 日本黄色视频三级网站网址| ponron亚洲| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 少妇被粗大猛烈的视频| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜激情欧美在线| 免费av观看视频| 久久精品人妻少妇| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 少妇高潮的动态图| 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费观看性生交大片5| 国产精品伦人一区二区| 搞女人的毛片| 久久国产乱子免费精品| 九色成人免费人妻av| 1024手机看黄色片| 成人美女网站在线观看视频| 精品国产露脸久久av麻豆 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 床上黄色一级片| 免费黄色在线免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 22中文网久久字幕| 国产成人福利小说| 秋霞在线观看毛片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 男人舔奶头视频| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久99热这里只有精品18| 卡戴珊不雅视频在线播放| av线在线观看网站| 成年版毛片免费区| www.色视频.com| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲av成人精品一区久久| 国产高潮美女av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 干丝袜人妻中文字幕| 国产免费男女视频| 亚洲av成人精品一二三区| 成人无遮挡网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 51国产日韩欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| 成人二区视频| 黄色一级大片看看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产伦理片在线播放av一区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99视频精品全部免费 在线| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲成人久久爱视频| 国产午夜精品论理片| 久久亚洲精品不卡| 一本久久精品| 国产日韩欧美在线精品| 在线天堂最新版资源| 色哟哟·www| 成人av在线播放网站| 特级一级黄色大片| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲成人av在线免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 搞女人的毛片| 99久久精品热视频| 99久久精品国产国产毛片| 99久久精品一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 91久久精品国产一区二区成人| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 三级国产精品欧美在线观看| 有码 亚洲区| 超碰97精品在线观看| 久久久久国产网址| 国产成人免费观看mmmm| 99在线视频只有这里精品首页| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 午夜a级毛片| 99在线视频只有这里精品首页| 日韩欧美在线乱码| 日本色播在线视频| 亚洲综合精品二区| 国产精品野战在线观看| 国产一区二区三区av在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品熟女少妇av免费看| 有码 亚洲区| 久久99热6这里只有精品| 国产伦理片在线播放av一区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99久国产av精品国产电影| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品,欧美精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产高清三级在线| 久久久午夜欧美精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产成人freesex在线| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩欧美在线乱码| 亚洲美女视频黄频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| www.av在线官网国产| 国产亚洲91精品色在线| 免费看日本二区| 高清午夜精品一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲不卡免费看| 精品人妻偷拍中文字幕| 色播亚洲综合网| 男女那种视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 听说在线观看完整版免费高清| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日韩av不卡免费在线播放| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲不卡免费看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产高清有码在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产 一区精品| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 有码 亚洲区| 成人亚洲精品av一区二区| 国产极品精品免费视频能看的| 久久综合国产亚洲精品| 日本一本二区三区精品| 亚洲欧美精品专区久久| 性色avwww在线观看| 日韩成人伦理影院| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜激情福利司机影院| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99九九线精品视频在线观看视频| 中文字幕制服av| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲av一区综合| 丝袜喷水一区| 欧美又色又爽又黄视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 级片在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 能在线免费看毛片的网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 草草在线视频免费看| 国产美女午夜福利| 亚洲av二区三区四区| 亚洲国产欧美人成| 亚洲不卡免费看| 日本五十路高清| 亚洲欧美日韩高清专用| 伦精品一区二区三区| 国产私拍福利视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| av.在线天堂| 岛国在线免费视频观看| 免费观看精品视频网站| 午夜a级毛片| 免费在线观看成人毛片| 99视频精品全部免费 在线| 视频中文字幕在线观看| 国产淫语在线视频| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜激情福利司机影院| av天堂中文字幕网| 中国国产av一级| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | ponron亚洲| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品不卡视频一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 青春草国产在线视频| 天堂中文最新版在线下载 | 级片在线观看| 村上凉子中文字幕在线| av女优亚洲男人天堂| 免费av不卡在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 可以在线观看毛片的网站| 如何舔出高潮| 色网站视频免费| 久久精品久久精品一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日韩制服骚丝袜av| 免费看日本二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 春色校园在线视频观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲怡红院男人天堂| 青春草国产在线视频| 精品一区二区三区人妻视频| 国产免费视频播放在线视频 | 91狼人影院| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲国产精品久久男人天堂| 婷婷色麻豆天堂久久 | 国产黄片美女视频| 嫩草影院精品99| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费av毛片视频| 国产精品蜜桃在线观看| 22中文网久久字幕| 日本一二三区视频观看| 亚洲成色77777| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩成人伦理影院| 国国产精品蜜臀av免费| 国产成人精品一,二区| 国产精品一及| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品自拍成人| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲成色77777| 69av精品久久久久久| 国产伦在线观看视频一区| 国产高清国产精品国产三级 | 国产色婷婷99| 99久久中文字幕三级久久日本| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美又色又爽又黄视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品熟女少妇av免费看| 69av精品久久久久久| 国产探花极品一区二区| 国产高清国产精品国产三级 | 夫妻性生交免费视频一级片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 搞女人的毛片| av在线天堂中文字幕| 赤兔流量卡办理| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲av成人精品一区久久| 日日撸夜夜添| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美bdsm另类| 欧美成人精品欧美一级黄| 黄片无遮挡物在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久久色成人| 日本免费在线观看一区| 一区二区三区乱码不卡18| 一个人看的www免费观看视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲,欧美,日韩| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 久久精品综合一区二区三区| 日韩一区二区视频免费看| 九色成人免费人妻av| 最近最新中文字幕大全电影3| 美女国产视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 乱人视频在线观看| 天堂网av新在线| 日韩三级伦理在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 免费av毛片视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 高清毛片免费看| 亚洲伊人久久精品综合 | 小说图片视频综合网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美激情久久久久久爽电影| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲在久久综合| 免费看美女性在线毛片视频| 久久亚洲国产成人精品v| 我要看日韩黄色一级片| kizo精华| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 尾随美女入室| 我要搜黄色片| 日本熟妇午夜| 久久6这里有精品| 免费无遮挡裸体视频| 男女视频在线观看网站免费| 一个人看的www免费观看视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 在线a可以看的网站| 丰满少妇做爰视频| 日本免费在线观看一区| 精品欧美国产一区二区三| 日本-黄色视频高清免费观看| 一本一本综合久久| 边亲边吃奶的免费视频| 乱系列少妇在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 99热这里只有是精品在线观看| 国产 一区精品| 九九爱精品视频在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产在视频线精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久6这里有精品| 青春草视频在线免费观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 有码 亚洲区| 国产精品国产三级国产专区5o | 日日啪夜夜撸| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产精品久久久久久久久免| 久久久久久九九精品二区国产| 国产美女午夜福利| 久久久午夜欧美精品| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲精品,欧美精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 热99在线观看视频| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品电影一区二区三区| 乱人视频在线观看| 黄色配什么色好看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av.在线天堂| 最近2019中文字幕mv第一页| 两个人的视频大全免费| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲成人中文字幕在线播放| 高清毛片免费看| 黑人高潮一二区| 国产精品野战在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲在久久综合| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产av码专区亚洲av| 国产淫片久久久久久久久| 国产三级中文精品| 国产单亲对白刺激| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜精品国产一区二区电影 | 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品av视频在线免费观看| 国产成人精品一,二区| 久久久精品94久久精品| 搞女人的毛片| 午夜福利在线观看吧| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 床上黄色一级片| av在线亚洲专区| 精品久久久久久久末码| 大话2 男鬼变身卡| 久久人人爽人人片av| 五月伊人婷婷丁香| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品久久久久久久久av| 一个人看视频在线观看www免费|