鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白34的表達(dá)純化及其生物活性分析

安志遠(yuǎn) 蘇建榮

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100050）

鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白34的表達(dá)純化及其生物活性分析

安志遠(yuǎn) 蘇建榮

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100050）

通過(guò)基因克隆方法制備鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606（Acinetobacter baumannii ATCC 19606）外膜蛋白34（Outer membrance protein 34，Omp34），并分析其生物結(jié)構(gòu)及對(duì)HEK293細(xì)胞的凋亡作用。采用PCR方法擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606 Omp34基因，并將其克隆到表達(dá)載體pET28a（+）以構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a（+）-Omp34，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并用鎳柱親和層析純化蛋白，使用L-精氨酸和還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）可使Omp34蛋白正確復(fù)性，生物信息預(yù)測(cè)Omp34生物結(jié)構(gòu)，利用圓二色譜（Circular dichroism CD）技術(shù)測(cè)定Omp34的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)Omp34對(duì)HEK293細(xì)胞的凋亡作用。成功構(gòu)建表達(dá)載體pET28a（+）-Omp34，并在原核表達(dá)體系中高效表達(dá)，通過(guò)復(fù)性得到可溶蛋白。生物信息預(yù)測(cè)Omp34為β桶狀蛋白，圓二色譜證實(shí)Omp34結(jié)構(gòu)為β折疊結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋含量為12%、β-折疊為39%、β-轉(zhuǎn)角為22%、無(wú)規(guī)則卷曲為27%。復(fù)性的Omp34可使HEK293細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過(guò)分子克隆技術(shù)成功獲得了鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白34，并解析出其二級(jí)結(jié)構(gòu)，證實(shí)其可以導(dǎo)致HEK293細(xì)胞凋亡，這為將來(lái)進(jìn)一步研究鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白34的生物學(xué)功能及其耐藥機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

鮑曼不動(dòng)桿菌；外膜蛋白34；包涵體；圓二色譜；凋亡

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵的革蘭氏陰性的機(jī)會(huì)致病菌，可以引起呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、敗血癥、泌尿系感染、腦膜炎等疾病，它可以造成嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)損害，是醫(yī)院獲得性感染的重要致病菌［1］。近年來(lái)由于抗生素的濫用，鮑曼不動(dòng)桿菌的抗生素耐藥問(wèn)題已經(jīng)日漸突出，臨床出現(xiàn)大量多耐藥菌株，甚至出現(xiàn)了多粘菌素和替加環(huán)素耐藥菌株，給治療帶來(lái)了極大困難，增加患者的死亡率，急需找到一種治療感染的新方法［2-4］。鮑曼不動(dòng)桿菌已被美國(guó)傳染病協(xié)會(huì)列為6種最危險(xiǎn)微生物之一［5］。但到目前為止，鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)制及其導(dǎo)致抗生素耐藥的機(jī)制尚不明確。

研究表明鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白（Outer membrane protein，OMP）是其毒力的主要部分，在鮑曼不動(dòng)桿菌的致病性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。外膜蛋白是鑲嵌在革蘭氏陰性菌脂質(zhì)雙層中的特殊蛋白，它是由反向平行的β-折疊通過(guò)相鄰氫鍵連接而成的β-桶狀結(jié)構(gòu)，維護(hù)菌體外膜的穩(wěn)定性，抵御外界不利環(huán)境，承擔(dān)著細(xì)菌與外界物質(zhì)的運(yùn)輸交換等生物學(xué)功能［6］。外膜蛋白存在于菌體分泌的外膜囊泡中（Outer membrane vesicles，OMVs），外膜囊泡可以和宿主細(xì)胞膜表面的脂閥（lipid rafts）相互作用，將外膜蛋白等毒力因子釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7］。Smani［8］通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)從鮑曼不動(dòng)桿菌分泌的OMVs中鑒定出了Omp34，它是鮑曼不動(dòng)桿菌的主要毒力蛋白之一，Omp34是纖維連接蛋白的配體，可使鮑曼不動(dòng)桿菌黏附侵襲宿主細(xì)胞。McConnell MJ用鮑曼不動(dòng)桿菌OMVs免疫小鼠后可以產(chǎn)生IgG類抗體，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌再感染具有保護(hù)作用，菌體分泌的OMVs中含有6種主要毒力蛋白其中也包括Omp34［9］。

Omp34和外膜蛋白33（Outer membrance protein 33，Omp33）是2005年由Germán Bou從鮑曼不動(dòng)桿菌JC10/01和JC7/04株上克隆出來(lái)的，研究指出這兩種蛋白與抗生素耐藥高度相關(guān)，其表達(dá)失活可以提高鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯藥物的耐藥率［10］。但目前僅有報(bào)道證實(shí)Omp33可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡并具有調(diào)節(jié)自噬的功能，其缺失會(huì)導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌的黏附侵襲力減低，減少細(xì)胞的死亡［11，12］。而到目前Omp34的結(jié)構(gòu)和其導(dǎo)致宿主細(xì)胞的毒性作用等生物學(xué)功能的研究國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。由于命名上的差異，有的學(xué)者將這兩種蛋白認(rèn)定為同一蛋白［12］。我們通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Omp34與Omp33存在較高同源性，基因序列的相似度為76%，氨基酸序列的相似度為68%，但很顯然它們不是同一蛋白。Smani［11］在研究中也提到了Omp34與Omp33基因序列的差異。Omp34與Omp33同屬于外膜蛋白家族，基因和氨基酸序列間又有很高相似度，我們推斷Omp34與Omp33可能具有類似的生物學(xué)功能，Omp34可能是鮑曼不動(dòng)桿菌非常重要的毒力蛋白之一，其在鮑曼不動(dòng)桿菌侵襲宿主方面可能發(fā)揮了重要作用。所以發(fā)現(xiàn)解析鮑曼不動(dòng)桿菌Omp34的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能就顯得非常重要，這將從一個(gè)新的視角了解鮑曼不動(dòng)桿菌的致病性，為將來(lái)解釋鮑曼不動(dòng)桿菌感染宿主的機(jī)制，以及研究其三級(jí)結(jié)構(gòu)尋找藥物作用靶點(diǎn)治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供了數(shù)據(jù)支持。

本研究旨在通過(guò)分子克隆技術(shù)獲取鮑曼不動(dòng)桿菌Omp34，利用圓二色譜技術(shù)檢測(cè)Omp34的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)功能試驗(yàn)分析其對(duì)宿主細(xì)胞的凋亡作用，為進(jìn)一步研究鮑曼不動(dòng)桿菌分子致病機(jī)制及研發(fā)治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Acinetobacter baumannii ATCC 19606和HEK293細(xì)胞（CRL-1573）購(gòu)自美國(guó)ATCC；pET28a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、High Affinity Ni-NTA resin、質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、CCK8試劑購(gòu)自全式金公司（Transgene biotech）；限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I購(gòu)自NEB公司；T4 High Ligation V3.0購(gòu)自TaKaRa公司；超濾管購(gòu)自milipore公司；His多克隆抗體夠自CST公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；SK3071非干擾型蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海生工；引物和測(cè)序由北京奧科公司完成；Anti-cleaved-caspase3和Anticleaved-PARP購(gòu)自Abcam公司；GAPDH抗體購(gòu)自CST公司；核酸電泳儀和蛋白質(zhì)電泳儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；圓二色譜儀J-715為日本Jasco公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為Beckman coulter公司產(chǎn)品；其余試劑為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌Omp34基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的Omp34基因（AM039631.1）序列，設(shè)計(jì)引物Ab-Omp34F：5'-TTTGGATCCATGAAAAAACTTGGTTT-3'（劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)），Ab-Omp34R：5'-GAACTCGAGGAAACGGAATTTAGCA-3'（劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)），以鮑曼不動(dòng)桿菌基因組DNA為模板擴(kuò)增Omp34基因。PCR擴(kuò)增體系為：上下游引物（10 μmol/L）各1.25 μL，dNTP 0.2 μL，10x緩沖液10 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 s，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，目的條帶用DNA凝膠純化試劑盒回收。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）-Omp34的構(gòu)建 將回收的擴(kuò)增產(chǎn)物Omp34和pET28a（+）載體分別用BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，回收Omp34和pET28a（+）載體，用T4連接酶（TaKaRa）16℃連接30 min，轉(zhuǎn)化E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃倒置培養(yǎng)16 h后從LB平板上挑取單克隆加入3 mL含 50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，選擇菌液PCR呈陽(yáng)性的菌液提取重組質(zhì)粒pET28a（+）-Omp34雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送北京奧科公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 Omp34誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式鑒定 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a（+）-Omp34轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)，37℃培養(yǎng)16 h后挑取單克隆接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素），37℃，200 r/min搖菌培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100加入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)，待OD600達(dá)到0.6時(shí)，分別在37℃、1 mmol/L IPTG或16℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)4 h，誘導(dǎo)結(jié)束后4℃，12 000×g離心10 min，菌體沉淀用500 μL lysis buffer（50 mmol/L Tris-Hcl，2 mmol/L EDTA，100 mmol/L Nacl，0.5%TritonX100）重懸，加入PMSF至終濃度為1 mmol /L，冰浴超聲裂解5-10 min。菌體裂解液于4℃，12 000×g離心10 min分離沉淀和上清，沉淀用500 μL lysis buffer重懸。之后加入電泳上樣緩沖液，95℃煮沸10 min，10%SDS-PAGE電泳及Coomassie Brilliant Blue法染色脫色檢測(cè)重組蛋白表達(dá)及其可溶性。

1.2.4 Omp34的親和層析純化 按照1.2.3方法誘導(dǎo)50 mL菌液，菌體沉淀溶于10 mL lysis buffer，超聲波裂解細(xì)菌10-20 min，使菌體裂解完全，4℃12 000×g離心10 min，棄掉上清，沉淀用lysis buffer洗2遍，之后離心取沉淀用5 mL solution buffe（r8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，0.1%Trition X-114，PH8.0）溶解，離心去除不溶解的沉淀部分，此時(shí)的上清部分可用于鎳柱層析純化。取2.5 mL Ni-NTA溶液裝柱，室溫靜置20 min，隨后在4℃條件下用上述solution buffer平衡層析柱10 min，將含有目的蛋白的溶解液加入層析柱，此時(shí)含有His標(biāo)簽的Omp34已結(jié)合在鎳柱上，之后用含有8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，0.1%Trition X-114，pH8.0的washing buffer洗滌層析柱，收集流穿液防止目的蛋白丟失，最后用含有8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑，pH8.0的elution buffer洗脫Omp34，在咪唑洗脫的過(guò)程中用考馬斯亮藍(lán)R250試劑檢測(cè)蛋白OD值的方法來(lái)判斷洗脫終點(diǎn)。

1.2.5 Omp34的復(fù)性、免疫印跡分析及蛋白濃度檢測(cè) 采用兩種復(fù)性緩沖液分別透析。第1種復(fù)性緩沖液成分為（0.1 mol/L Tris-HCl pH8.5，2 mmol/L EDTA，6 mol/L尿素），第2種復(fù)性緩沖液成分參照文獻(xiàn)［13-16］向第1種復(fù)性緩沖液中加入1 mol/L L-精氨酸、2 mmol/LGSH、0.2 mmol/LGSSG，其余成分不變。將含有Omp34的透析袋分別置于上述2種復(fù)性緩沖液，4℃下低速攪拌透析12 h，再逐步降低復(fù)性緩沖液中尿素的含量（4 mol/L、2 mol/L和1 mol/L）梯度透析各8 h，最后用PBS透析過(guò)夜去除殘存的尿素。透析結(jié)束后收集透析袋中的蛋白放入截流10 kD以上蛋白的超濾管濃縮（milipore），最后用10% SDS-PAGE分析復(fù)性蛋白純度并用Western blot鑒定，SK3071非干擾型蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.6 Omp34的圓二色譜分析 應(yīng)用J-715（日本Jasco）圓二色譜儀，在20℃條件下對(duì)純化蛋白Omp34進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定。波長(zhǎng)掃描范圍為190-250 nm（遠(yuǎn)紫外區(qū)），掃描速度200 nm/min，步長(zhǎng)1 nm，樣品池厚度1 mm，停留時(shí)間1 min，掃描次數(shù)3次，以PBS緩沖液作為空白對(duì)照。取信號(hào)平均值并進(jìn)行基線校正。CD譜利用spectra manager軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所得數(shù)據(jù)用Dichroweb進(jìn)行在線二級(jí)結(jié)構(gòu)分析（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk），選擇CDSSTR算法計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量。

1.2.7 Omp34結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 應(yīng)用bioinf程序（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk）和Predict Protein程序（https://www.predictprotein.org/）預(yù)測(cè)Omp34二級(jí)結(jié)構(gòu)。PRED-TMBB（http://bioinformatics.biol.uoa.gr/ PRED-TMBB/）預(yù)測(cè)Omp34跨膜域結(jié)構(gòu)。Phyre2程序（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）預(yù)測(cè)Omp34的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.8 Omp34刺激HEK293細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞以每孔5×103接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基100 μL。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用不同濃度的Omp34（5、10、20、40 μg/mL）刺激HEK293細(xì)胞12 h，觀察10 μg/mL濃度下細(xì)胞形態(tài)。之后加入CCK-8試劑10 μL，再孵育4 h。450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的OD值。細(xì)胞存活率（%）=［A（Omp34）-A（空白）］/［A（對(duì)照）-A（空白）］，其中A（Omp34）=具有細(xì)胞、CCK8試劑和Omp34的孔的吸光度；A（空白）=具有培養(yǎng)基和CCK8試劑而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度；A（對(duì)照）=具有細(xì)胞、CCK8試劑而沒(méi)有Omp34的孔的吸光度。

1.2.9 流式細(xì)胞檢測(cè)Omp34對(duì)HEK293的凋亡作用 HEK293以5×104個(gè)細(xì)胞接種在6孔板上，無(wú)菌培養(yǎng)24 h后用10 μg/mL Omp34刺激12 h后離心收集細(xì)胞，PBS洗3遍，之后取PBS重懸細(xì)胞液500 μL，加入500 μL binding buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育15 min后用流式細(xì)胞儀（Beckman coulter Gallios）檢測(cè)。以Annexin V+/PI-判斷為早期凋亡，以Annexin V+/PI +判斷為晚期凋亡，兩種凋亡率之和為總凋亡率。

1.2.10 Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) HEK293細(xì)胞按每孔1×106個(gè)接種在6孔板，無(wú)菌培養(yǎng)24 h后，以未刺激的細(xì)胞作為對(duì)照組，刺激組加入10 μg/mL Omp34分別培養(yǎng)12 h、24 h。RIPA裂解液收集細(xì)胞，冰上超聲破碎，放置20 min后，12 000×g離心5 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，樣品加入6×loading buffer，95℃，10 min，之后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜條件100 V、1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，之后用一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌10 min×3次，用IRdye680熒光標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶20 000）室溫孵育1 h，PBST洗滌10 min×3次，用Odyssey紅外激光成像儀（LI-COR）進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 pET28a（+）-Omp34表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到Omp34基因，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小900 bp與預(yù)期片段（AM039631.1）大小相一致（圖1-A），未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增帶。將擴(kuò)增的目的片段與表達(dá)載體pET28a（+）用BamH I和Xho I雙酶切，用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用Omp34特異性引物進(jìn)行菌液PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1-B。測(cè)序鑒定為陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切，獲得約5.3 kb和0.9 kb兩條帶，大小與載體片段和目的片段長(zhǎng)度相符，結(jié)果見(jiàn)圖1-C。pET28a（+）-Omp34的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1-D。

2.2 Omp34表達(dá)形式及表達(dá)條件優(yōu)化鑒定

重組質(zhì)粒pET28a（+）-Omp34轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h，用10% SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果（圖2-A）顯示，與誘導(dǎo)前相比，IPTG誘導(dǎo)后可以表達(dá)32 kD左右的蛋白。重組菌經(jīng)37℃，1 mmol/LIPTG條件下誘導(dǎo)后上清中無(wú)目的蛋白表達(dá)，目的蛋白均大量表達(dá)于沉淀中（圖2-B）。在16℃，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下目的蛋白表達(dá)形式依然沒(méi)有變化，說(shuō)明降低IPTG濃度和溫度對(duì)Omp34表達(dá)形式?jīng)]有影響，Omp34以包涵體形式表達(dá)（圖2-C）。

圖1 pET28（+）-Omp34表達(dá)載體的構(gòu)建

圖2 重組Omp34表達(dá)鑒定及其表達(dá)形式分析

2.3 Omp34的純化、蛋白濃度測(cè)定及western blot檢測(cè)

將構(gòu)建的高表達(dá)大腸桿菌BL21-pET28a（+）-Omp34擴(kuò)大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析純化、包涵體復(fù)性和超濾濃縮，得到的Omp34完整性良好，純度較高，超濾后流穿液中沒(méi)有目的蛋白，說(shuō)明蛋白截留成功（圖3-A）。取復(fù)性后的Omp34進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果（圖3-B）顯示該重組蛋白能被抗His標(biāo)簽抗體識(shí)別，在32 kD左右顯示出特異條帶。純化后的Omp34采用SK3071非干擾型蛋白定量試劑盒測(cè)定，蛋白濃度為1.90 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=-129.75x+121.17，R2=0.997 3。

圖3 Omp34純化和免疫印跡鑒定

2.4 Omp34圓二色譜鑒定結(jié)果

通過(guò)圓二色譜鑒定后發(fā)現(xiàn)，采用梯度降低尿素濃度的復(fù)性方法得到的Omp34不具有β-折疊結(jié)構(gòu)，蛋白沒(méi)有恢復(fù)天然構(gòu)象（圖4-A）。而在復(fù)性液中加入L-精氨酸和GSH/GSSG可以促進(jìn)二硫鍵的正確形成，使不正確連接的二硫鍵重新配對(duì)，引導(dǎo)蛋白正確折疊，從而使包涵體中復(fù)性的蛋白恢復(fù)天然構(gòu)象。經(jīng)檢測(cè)Omp34的圓二色譜曲線在195 nm處有一凸峰、210-215 nm處有一凹峰，是典型的β-折疊結(jié)構(gòu)，說(shuō)明蛋白恢復(fù)了天然構(gòu)象。通過(guò)在線分析軟件Dichroweb計(jì)算出Omp34的α-螺旋含量為12%、β-折疊為39%、β-轉(zhuǎn)角為22%、無(wú)規(guī)則卷曲為27%。Omp34的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲為主，符合革蘭氏陰性菌外膜蛋白β桶狀結(jié)構(gòu)（圖4-B）。2.5 Omp34結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

Bioinf程序預(yù)測(cè)的Omp34二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲為主（圖5-A）。PRED-TMBB程序預(yù)測(cè)Omp34的C端跨膜結(jié)構(gòu)域由14個(gè)β-片層組成，N端周質(zhì)空間結(jié)構(gòu)域不形成β-片層結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)Omp34具有典型的革蘭氏陰性菌的外膜蛋白β-桶狀結(jié)構(gòu)（β-barrel）（圖5-B）。Predict Protein程序是預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的金標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)Omp34的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占10.37%、β折疊38.8%、loop結(jié)構(gòu)占50.84%。圓二色譜測(cè)定結(jié)果與Predict Protein程序預(yù)測(cè)的結(jié)果相似度較高。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以鼠疫耶爾森菌Ail蛋白為模板（PDB：c3qraA），結(jié)果（圖5-C）顯示Omp34為β桶狀蛋白，可信度為99%、覆蓋率為49%、一致性為14%。

2.6 Omp34刺激HEK293細(xì)胞形態(tài)觀察

用PBS處理的HEK293細(xì)胞形態(tài)正常（圖6-A）。而Omp34刺激12 h的HEK293細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜出泡，染色質(zhì)凝集等細(xì)胞凋亡的特征性改變（圖6-B）。

2.7 CCK8檢測(cè)Omp34刺激的HEK293細(xì)胞存活率

在不同濃度（0、5、10、20和40 μg/mL）Omp34刺激12 h后，隨著Omp34刺激濃度增加，OD值呈梯度下降，該作用具有劑量依賴性。5、10、20和40 μg/mL Omp34刺激HEK293細(xì)胞12 h后，其存活率顯著下降，分別為84.3%、54.9%、43.4%和30.5%，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x-± s，*P<0.05）。大約10 μg/mL濃度為HEK293細(xì)胞的半數(shù)致死濃度（IC50），結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖4 Omp34圓二色譜檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的Omp34結(jié)構(gòu)圖

圖6 Omp34感染HEK293細(xì)胞形態(tài)觀察

圖7 Omp34對(duì)HEK293細(xì)胞存活率的影響

2.8 Omp34對(duì)HEK293細(xì)胞的凋亡作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖8-A）顯示，PBS處理的HEK293細(xì)胞的凋亡率為6.5%，而經(jīng)10 μg/mL Omp34刺激12 h后的HEK293凋亡率明顯上升，為20.4%（圖8-B），Omp34組的凋亡率與PBS組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x-± s，*P< 0.05）（圖8-C）。為進(jìn)一步確定凋亡發(fā)生，我們檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白caspase3和PARP的裂解活化部分：Cleavedcaspase3和Cleaved-PARP。在10 μg/mL Omp34刺激12 h后，HEK293細(xì)胞中的caspase3和PARP被激活，其活性部分表達(dá)量升高，具有時(shí)間依賴性（圖8-D），與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x-± s，*P< 0.05）（圖8-E和8-F）。

圖8 Omp34刺激HEK293細(xì)胞凋亡分析

3 討論

本研究成功構(gòu)建了pET28a（+）-Omp34表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果表明目的基因片段與GenBank中（AM039631.1）鮑曼不動(dòng)桿菌Omp34基因序列100%一致。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，此次表達(dá)純化的Omp34與GenBank中（CAJ01528.1）報(bào)道的Omp34分子量（32 kD）大小一致。但Omp34在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中以包涵體形式存在，通過(guò)優(yōu)化復(fù)性條件得到可溶蛋白，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明Omp34二級(jí)結(jié)構(gòu)中具有大量β折疊，三級(jí)結(jié)構(gòu)為β桶狀蛋白。圓二色譜也證實(shí)了Omp34為β折疊結(jié)構(gòu)。功能試驗(yàn)表明Omp34具有引發(fā)宿主細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。

為了使Omp34形成可溶性表達(dá)，我們采用降低誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑含量的方法，但這并不能使Omp34形成可溶性表達(dá)，雖然誘導(dǎo)條件的改變對(duì)重組蛋白的表達(dá)有一定的影響，如溫度、IPTG濃度、pH值等，但蛋白是否可以形成可溶性表達(dá)還是由蛋白本身的特性決定的。通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)到Omp34結(jié)構(gòu)中存在疏水的跨膜域以及N端的分泌信號(hào)肽可能都會(huì)干擾其形成可溶性表達(dá)［17］。未來(lái)可以嘗試在表達(dá)載體上增加親水性標(biāo)簽或截去Omp34N端信號(hào)肽序列或許可以使蛋白形成可溶性表達(dá)。

生物功能方面，Omp34可使HEK293細(xì)胞形態(tài)發(fā)生凋亡壞死樣改變。CCK8實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Omp34可導(dǎo)致HEK293細(xì)胞的存活率降低，具有劑量依賴性。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)一步證明Omp34有促進(jìn)HEK293細(xì)胞凋亡作用。上述結(jié)果表明此次從包涵體中復(fù)性的Omp34具有良好生物學(xué)活性，初步證實(shí)其對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性作用，它與已報(bào)道的Omp33具有相似功能。研究表明［12］Omp33引起的細(xì)胞自噬是一種不完全自噬，即其不能被溶酶體降解，這就為鮑曼不動(dòng)桿菌在自噬體內(nèi)大量繁殖創(chuàng)造了必要條件。與它同源的Omp34是否也具有類似的功能，還有待研究證實(shí)。未來(lái)我們會(huì)繼續(xù)研究Omp34對(duì)宿主的毒性作用，以及其在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮的作用，了解Omp34與宿主細(xì)胞內(nèi)部分子蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以從新的視角解析鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)理。

細(xì)菌的外膜孔蛋白是外來(lái)分子通過(guò)的通道，參與了多種抗菌藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗生素耐藥的其中一個(gè)重要機(jī)制就是其外膜孔蛋白的缺失，致使抗生素不能通過(guò)此孔道進(jìn)入菌體內(nèi)部，使細(xì)菌內(nèi)抗生素濃度降低，當(dāng)?shù)陀谟行舛葧r(shí)就會(huì)出現(xiàn)耐藥［18］。本研究證實(shí)Omp34也是鮑曼不動(dòng)桿菌的一種外膜孔蛋白，其有可能是抗生素進(jìn)入菌體的一個(gè)重要通道，缺失Omp34的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳?xì)涿赶╊惪股啬退帲覀兺茰y(cè)它可能是碳?xì)涿赶╊惪股剡M(jìn)入菌體的特異性通道。因此Omp34在鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥研究方面具有舉足輕重的地位。另外，外膜蛋白作為鮑曼不動(dòng)桿菌的主要毒力因子，具有較好的免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，現(xiàn)有研究表明多種外膜蛋白可以作為鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗研發(fā)的靶點(diǎn)［19-21］。但從我們的發(fā)現(xiàn)來(lái)看，Omp34即便具有很好的免疫原性，但它是一個(gè)膜孔蛋白，其與耐藥十分相關(guān)，因此可能不適合作為疫苗的候選蛋白。因?yàn)楫?dāng)Omp34缺失時(shí)，鮑曼不動(dòng)桿菌就會(huì)對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥，一旦用其作為疫苗免疫宿主后，宿主便產(chǎn)生了大量針對(duì)Omp34的抗體，帶有Omp34的鮑曼不動(dòng)桿菌會(huì)被免疫反應(yīng)清除，但缺失Omp34的鮑曼不動(dòng)桿菌會(huì)因此成為優(yōu)勢(shì)株而大量繁殖，不但疫苗對(duì)其無(wú)法起作用，而且還會(huì)造成更嚴(yán)重的耐藥，將為臨床治療帶來(lái)巨大問(wèn)題，因此我們認(rèn)為將其作為疫苗成分還有待商榷。

4 結(jié)論

本研究采用原核表達(dá)及優(yōu)化包涵體復(fù)性的方法成功獲得高純度的鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606的Omp34，并用圓二色譜鑒定和生物信息分析證明其具有β折疊結(jié)構(gòu)，是一個(gè)外膜孔蛋白。純化的Omp34具有良好的生物學(xué)活性可使HEK293細(xì)胞發(fā)生凋亡。這為進(jìn)一步研究鮑曼不動(dòng)桿菌Omp34的生物學(xué)功能、解釋其耐藥機(jī)制及研發(fā)治療感染的新藥物奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression and Purification of Outer Membrane Protein 34 of Acinetobacter baumannii and Analysis of Its Bioactivity

AN Zhi-yuan SU Jian-rong
（Clinical Laboratory center，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050）

The present study is to clone and purify the outer membrane protein 34（Omp34）from Acinetobacter baumannii ATCC 19606，and to analyze its biological structure and effects on the apoptosis of HEK293 cells. First，the gene of outer membrane protein 34 of A. baumannii ATCC 19606 was amplified by PCR，it was cloned into the pET28a（+）vector to generate the pET28a（+）-Omp34 expression vector，and the vector was transformed into Escherichia coli BL21 for expression. Then，the recombinant protein was expressed by IPTG induction and purified by Ni-affinity chromatography. L-arginine and GSH/GSSG were added in the dialysis buffer to facilitate the Omp34 protein correct folding. The biological structure of Omp34 was predicted by bioinformatics. The secondary structure of the Omp34 was detected by circular dichroism（CD）.The apoptosis of HEK293 cells induced by Omp34 were measured by flow cytometry and Western blot. As results，the pET28a（+）-Omp34 recombinant expression vector was successfully constructed，the Omp34 was highly expressed in prokaryotic expression system，and the soluble protein was obtained by refolding. Bioinformatics predicted that Omp34 was beta barrel-shape. CD confirmed that the secondary structure of purified Omp34 was beta sheets，of which the α-helix，β-sheets，and β-turn，and random coil of the Omp34 were 12%，39%，22%，and 27%，respectively. The re-natured Omp34 was able to induce the apoptosis of HEK293 cells. In summary，the Omp34 of A. baumannii can be expressed by molecular cloning technology. Moreover，its secondary structure was analyzed and it is demonstrated that Omp34 can lead to apoptosis of HEK293 cells. This work provides a basis for further study of the biological functions and antibiotic resistance mechanism of A. baumannii Omp34.

Acinetobacter baumannii；outer membrane protein 34；inclusion body；circular dichroism；apoptosis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0102

2017-02-17

安志遠(yuǎn)，男，碩士研究生，研究方向：鮑曼不動(dòng)桿菌毒力因子與宿主間相互作用；E-mail：mran850712@aliyun.com

蘇建榮，女，博士，研究方向：抗菌藥物用藥機(jī)制和診斷治療；E-mail：youyilab@163.com