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    蛋白激酶BIN2的純化及活性分析

    2017-07-12 18:05:57袁敏齊玉榮王瑞菊
    生物技術(shù)通報(bào) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶

    袁敏齊玉榮王瑞菊

    (1. 華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心,唐山 063000;2. 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石家莊 050024)

    蛋白激酶BIN2的純化及活性分析

    袁敏1齊玉榮2王瑞菊2

    (1. 華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心,唐山 063000;2. 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石家莊 050024)

    BIN2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在油菜素內(nèi)酯(BR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。為了獲得具有激酶活性且不帶標(biāo)簽的BIN2蛋白,將BIN2基因構(gòu)建到帶eXact標(biāo)簽的pPAL8表達(dá)載體上,獲得BIN2基因的原核表達(dá)載體eXact-BIN2,轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)。摸索合適的誘導(dǎo)條件后成功誘導(dǎo)出51 kD 的eXact-BIN2蛋白。經(jīng)eXact純化介質(zhì)純化并切除標(biāo)簽,獲得質(zhì)量較高、不帶標(biāo)簽的BIN2蛋白。該BIN2蛋白具有較高的激酶活性,能夠在體外磷酸化MBP-BZR1蛋白。

    BIN2;磷酸化;蛋白激酶;蛋白純化

    BIN2(Brassinosteroid Insensitive 2)是類糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)家族的成員。GSK3是一類在真核生物中非常保守的基因家族,廣泛參與調(diào)控眾多的生物學(xué)過程,具有典型的結(jié)構(gòu)特征,從N端到C端依次由可變域、保守激酶域及C末端域組成[1,2]。擬南芥中GSK-LIKE家族共有10個(gè)成員,依據(jù)序列同源性又可細(xì)分為4個(gè)亞家族,其中BIN2是II亞家族中的AtSK21。擬南芥GSK-LIKE成員在植物BR(Brassinosteroid,油菜素內(nèi)酯)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、花發(fā)育、側(cè)根的發(fā)育、非生物脅迫響應(yīng)和氣孔發(fā)育等多方面發(fā)揮重要作用[3-9]。

    在擬南芥中BIN2作為負(fù)調(diào)控因子參與BR信號(hào)通路。BR是一種重要的植物內(nèi)源激素,在植物細(xì)胞伸長(zhǎng),維管組織分化,植物的抗逆抗病等諸多生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,它是目前公認(rèn)的繼生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯之后被發(fā)現(xiàn)的第六大類植物激素。BR合成缺失突變體或?qū)R不敏感的突變體表現(xiàn)為植株矮小、葉片暗綠及暗中光形態(tài)建成等表型[10,11]。近年來,關(guān)于BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究一直是生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一,并且取得了很多重大的科研成果,鑒定出了很多參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的組分,BR 通過一條磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)基因表達(dá)。當(dāng)植物體內(nèi)BR濃度較低時(shí),BIN2持續(xù)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子BZR1(Brassinazole Resistant 1)和BES1(bri1-Ethylmethane Suppressor 1)。隨著BR濃度升高,BIN2的活性受到抑制,失活的BIN2不能繼續(xù)磷酸化下游的BZR1和BES1,而BZR1和BES1會(huì)被蛋白磷酸酶PP2A(Protein Phosphatase 2A)去磷酸化進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)。在這一系列的蛋白質(zhì)可逆磷酸化修飾過程中,激酶BIN2與磷酸酶PP2A相互配合控制核心轉(zhuǎn)錄因子BZR1/BES1的磷酸化狀態(tài)在BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮十分重要的作用[12-16]。近年來的研究表明,BIN2可以磷酸化并抑制MAPKKK(YDA)活性而參與植株氣孔發(fā)育[4,17]。BIN2在BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與植株氣孔發(fā)育的交叉互作中發(fā)揮核心作用?;贐IN2功能的重要性,純化BIN2蛋白并解析其晶體結(jié)構(gòu)將更有助于理解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

    目前,純化蛋白通常利用融合表達(dá)的親和標(biāo)簽,獲得帶有標(biāo)簽蛋白的融合蛋白。常用的標(biāo)簽有兩類:一類是一些多肽表位,能夠與固定在樹脂上的分子配體或多肽結(jié)合。如Flag 標(biāo)簽,生物素受體多肽標(biāo)簽以及鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽標(biāo)簽等;另一類是能夠與固定在層析介質(zhì)上的小分子配體結(jié)合的大蛋白標(biāo)簽,如GST,MBP標(biāo)簽等。無論哪種標(biāo)簽都會(huì)干擾蛋白的生物學(xué)活性,影響其晶體結(jié)構(gòu)。通常情況下可以用一種高度特異性的蛋白內(nèi)切酶切割和去除標(biāo)簽,但是這些蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的切割效率差異很大,并且蛋白切割操作步驟比較復(fù)雜,很可能在切割過程中對(duì)蛋白造成影響,比如蛋白質(zhì)變性、降解等。本研究中利用Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統(tǒng)很好的解決了上述問題。該系統(tǒng)把eXact標(biāo)簽與固定在純化介質(zhì)上的突變的絲氨酸蛋白酶結(jié)合,利用鹵素離子氟離子或者疊氮化鈉在標(biāo)簽和目的蛋白之間剪切,使標(biāo)簽滯留在純化介質(zhì)上,而目的蛋白從層析柱上洗脫下來。蛋白洗脫與切割一步完成,切割下來的目的蛋白不含有eXact純化標(biāo)簽的殘留,能夠保持目的蛋白本身的生理特性[18-20]。本研究擬利用Profinity eXact 純化系統(tǒng)來純化不帶標(biāo)簽的、且具有較好激酶活性的BIN2蛋白,為進(jìn)一步研究其蛋白晶體結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    基因克隆所用酶類及試劑購(gòu)于康為世紀(jì)公司;IPTG誘導(dǎo)劑購(gòu)于Sigma公司;eXact純化介質(zhì)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達(dá)載體的構(gòu)建 利用BIN2的基因特異引物擴(kuò)增獲得其全長(zhǎng)基因。將BIN2擴(kuò)增片段與空載體pPAL8分別用SpeⅠ和NotⅠ雙酶切,回收目的條帶,經(jīng)連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取一些克隆進(jìn)行雙酶切鑒定,選取酶切鑒定的陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序正確的重組載體eXact-BIN2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。1.2.2 IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)eXact-BIN2蛋白表達(dá)的影響 將轉(zhuǎn)化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,1∶200擴(kuò)培后繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600在0.6-0.8之間,分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG,在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導(dǎo)1-6 h收集菌體。SDS-PAGE電泳檢測(cè)eXact-BIN2蛋白表達(dá)情況,確定合適的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間。

    1.2.3 BIN2蛋白的純化 利用eXact介質(zhì)進(jìn)行純化。收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體,棄去上清,用樣品緩沖液(0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH7.2)重懸菌體,超聲破碎后,14 000 r/min 4℃離心15 min。收集上清液與eXact介質(zhì)低溫混勻1-2 h。1 500-2 000 g/min離心,棄去上清。用加入0.2% Triton-X100的樣品緩沖液洗滌eXact介質(zhì)數(shù)次除去雜蛋白。利用蛋白洗脫緩沖液(0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH7.2,0.1 mol/L NaF)與eXact介質(zhì)孵育5-10 min,離心收集洗脫液,重復(fù)洗脫多次。取0.5-1 μg獲得的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,檢測(cè)蛋白純化效果。

    1.2.4 體外蛋白激酶試驗(yàn) 準(zhǔn)備50 mmol/L Tris.HCl,pH7.4,10 μmol/L ATP,1 mmol/L MgCl2作為激酶反應(yīng)液。將1 μg BIN2蛋白與0.5 μg MBP-BZR1蛋白加入到激酶反應(yīng)液中至總體系20 μL,室溫孵育10-30 min。然后利用SDS-PAGE電泳通過分析電泳遷移率的變化判斷MBP-BZR1是否被BIN2磷酸化。蛋白質(zhì)被磷酸化后,分子量變大,電泳時(shí)遷移速度變慢,使用合適濃度的蛋白分離膠可以區(qū)分出磷酸化前后蛋白質(zhì)分子量的差異。因此,可以通過分析底物蛋白質(zhì)在激酶反應(yīng)前后的電泳遷移情況來判斷MBPBZR1是否被BIN2磷酸化。

    2 結(jié)果

    2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    利用基因特異性引物擴(kuò)增獲得1 143 bp的BIN2全長(zhǎng)基因(圖1-A),經(jīng)SpeⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定獲得大約1 000 bp的小片段和大約6 000 bp的大片段,分別與基因片段和空載體大小相符。再利用SpeⅠ進(jìn)行單酶切鑒定,獲得大約7 000 bp 的片段,與BIN2基因加空載體的總大小相符(圖1-B)。挑取克隆測(cè)序后獲得正確的eXact-BIN2原核表達(dá)載體。

    圖1 eXact-BIN2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    2.2 IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BIN2蛋白表達(dá)的影響

    將轉(zhuǎn)化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG,在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導(dǎo)1-6 h收集菌體。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明,誘導(dǎo)的eXact-BIN2融合蛋白為51 kD,并且該蛋白對(duì)誘導(dǎo)條件的要求并不十分嚴(yán)格,在37℃、30℃和23℃溫度下eXact-BIN2蛋白表達(dá)量均較高,0.1 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)效果也沒有明顯差異。

    圖2 不同誘導(dǎo)條件下eXact-BIN2融合蛋白的表達(dá)

    2.3 BIN2蛋白的純化

    經(jīng)過摸索,確定IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L,然后在37℃、30℃和23℃溫度下分別對(duì)BIN2蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)和純化。SDS-PAGE表明獲得的eXact-BIN2融合蛋白純度質(zhì)量均較高,洗脫后切除eXact標(biāo)簽的BIN2蛋白分子量大小為43 kD(圖3)。測(cè)定蛋白濃度,發(fā)現(xiàn)37℃誘導(dǎo)后純化的蛋白濃度較低,為93.4 μg/L;30℃誘導(dǎo)后純化的蛋白濃度為420.4 μg/L;23℃誘導(dǎo)后純化的BIN2蛋白濃度最高,為997.2 μg/L,可能是23℃誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生的可溶性BIN2蛋白量最多。

    2.4 蛋白激酶BIN2能夠磷酸化MBP-BZR1

    將試驗(yàn)所獲得的BIN2蛋白通過體外蛋白激酶試驗(yàn)檢測(cè)其活性,結(jié)果如圖4所示,跟孵育前的MBP-BZR1(泳道2)相比,與BIN2共同孵育后的MBP-BZR1分子量變大,電泳遷移變慢,表明MBPBZR1已經(jīng)被BIN2磷酸化成為磷酸化狀態(tài)的BZR1(pBZR1)(泳道3)。泳道1為單獨(dú)的MBP蛋白,泳道4為單獨(dú)的BIN2蛋白。

    圖3 切除eXact標(biāo)簽的BIN2蛋白的洗脫結(jié)果

    圖4 BIN2能夠體外磷酸化MBP-BZR1

    3 討論

    可逆磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,廣泛參與植物體內(nèi)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)、光合作用和衰老等眾多生物學(xué)過程。植物體內(nèi)蛋白激酶種類很多,BIN2作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,屬于GSK3家族成員,對(duì)其大部分底物都以負(fù)調(diào)節(jié)的作用方式發(fā)揮作用。BIN2通過磷酸化BZR1在BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[12]。

    研究蛋白質(zhì)修飾的試驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)利用標(biāo)簽來純化目的蛋白,然而,標(biāo)簽蛋白作為融合蛋白的一部分會(huì)一起被純化出來,并且標(biāo)簽的大小、親疏水性,以及帶電荷情況都會(huì)對(duì)目的蛋白的表達(dá)、可溶性以及活性等方面產(chǎn)生影響。為了避免標(biāo)簽的干擾,獲得更接近生理?xiàng)l件下的蛋白,純化不帶標(biāo)簽的蛋白是一種非常重要的手段。不帶標(biāo)簽的蛋白可以通過純化后對(duì)融合蛋白進(jìn)行標(biāo)簽剪切獲得,但是分離去除標(biāo)簽蛋白操作步驟比較復(fù)雜,并且可能在剪切過程中導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、降解等。Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統(tǒng)將蛋白洗脫與蛋白切割一步完成,切割下來的目的蛋白不含有純化標(biāo)簽,能夠保持目的蛋白本身的生理特性。這是與傳統(tǒng)的蛋白純化標(biāo)簽相比而具有的一個(gè)極大的優(yōu)點(diǎn)[19,20]。本研究獲得的不帶標(biāo)簽的BIN2蛋白保留了很好的激酶活性,能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。在純化過程中,多次重復(fù)試驗(yàn),收集的第一管蛋白洗脫液中都含有一個(gè)分子量大約70 kD的蛋白,推測(cè)可能是對(duì)維持BIN2正確構(gòu)象與激酶活性密切相關(guān)的伴侶蛋白,也可能是與純化介質(zhì)非特異結(jié)合的雜蛋白。

    4 結(jié)論

    本研究成功構(gòu)建了eXact-BIN2原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)出51 kD的eXact-BIN2融合蛋白。利用eXact純化介質(zhì)成功獲得了不帶標(biāo)簽的,大小約為43 kD的BIN2蛋白,該BIN2蛋白具有較好的激酶活性,能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。

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    (責(zé)任編輯 狄艷紅)

    Purification and Activity Analysis of Tag- free Protein Kinase BIN2

    YUAN Min1QI Yu-rong2WANG Rui-ju2
    (1. Center for Genomics and Computational Biology,College of Life Sciences,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000;2. College of Life Sciences,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024)

    BIN2 is a kind of Ser/Thr protein kinase,and plays important roles in BR signal transduction pathway. In order to obtain the active and tag-free BIN2 protein,the BIN2 gene was cloned into the prokaryotic expression vector pPAL8 to obtain BIN2-pPAL8 expression vector. The correct plasmid BIN2-pPAL8 was transformed into E.coli expression strain BL21(DE3). After exploring the proper induction conditions,the 51 kD eXact-BIN2 protein was successfully induced and purified using eXact purification system. The high-quality and tag-free BIN2 protein was obtained through cleaving the eXact tag. The purified BIN2 protein is highly active,which could phosphorylate MBP-BZR1 in vitro.

    BIN2;phosphorylation;protein kinase;protein purification

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1167

    2016-12-26

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401212,31201063),河北省自然科學(xué)基金(C2014209134,C2012205042)

    袁敏,女,博士,研究方向:植物生長(zhǎng)發(fā)育;E-mail:yuanmin308@163.com

    王瑞菊,女,博士,研究方向:植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);E-mail:15100149962@126.com

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