黑果枸杞組培無菌體系獲得及組培快繁技術研究

李媛媛 ，趙紅霞 ，趙學彩 ，劉 欣，李承科，孫仲序

（1.山東博華高效生態(tài)農業(yè)科技有限公司，山東 濱州 256500；2.山東農業(yè)大學）

1 引言

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬多年生小灌木，屬于一種鹽生藥用植物，具有抗旱、抗寒、耐鹽堿、根蘗性強和耐土壤貧瘠等諸多優(yōu)點，是鹽堿地治理、護坡、防止水土流失的良好樹種。無論在經濟產品開發(fā)，還是在生態(tài)環(huán)境治理方面都具有廣泛的市場前景和開發(fā)潛力，可以成為醫(yī)藥保健、經濟林建設和鹽堿地生物防治的重要經濟樹種[1]。目前，黑果枸杞的研究絕大多數(shù)集中在對其生理生態(tài)、有效成分分析、開發(fā)利用以及治理荒漠化和野生種源馴化等方面，而關于黑果枸杞組織培養(yǎng)與快速繁殖方面的研究報道較少。

本研究篩選出最佳無菌體系獲得方案，以及最適增殖和生根配方，從而建立黑果枸杞組織培養(yǎng)和快繁技術體系。并利用組織培養(yǎng)快繁技術對篩選出的適宜山東地區(qū)鹽堿地種植的黑果枸杞優(yōu)良品種進行快速繁殖，來保留植株原有的優(yōu)良性狀，將優(yōu)良單株快速繁殖成無性系，并在生產中大量推廣。

2 材料與方法

2.1 材料

材料來源于山東博華高效生態(tài)農業(yè)科技有限公司實驗田（東經118.07，北緯37.07）2年生枸杞實生苗枝條。選擇健康植株的中層當年生整枝為材料。

2.2 方法

2.2.1 無菌體系建立

6月選取優(yōu)良黑果枸杞枝條的不同位置莖段作為組織培養(yǎng)的外植體（枝條頂端、枝條上部、枝條中部、枝條下部），剪去葉片，保留葉柄基部0.5cm,洗潔精浸泡洗凈，置于自來水下流水沖洗2h。外植體消毒酒精消毒時間（10s、20s、30s、40s），升汞消毒時間（4min、8min、12min、16min）。整個消毒過程在無菌條件下進行，消毒后材料切成1～1.5cm的莖段 （包含1～2個腋芽），而后接種到已滅菌的初代培養(yǎng)基上，每組10瓶，每瓶3株，重復3次，接種7d后開始對外植體生長狀況進行觀察。

2.2.2 芽增殖繼代培養(yǎng)

選取初代培養(yǎng)25d后的組培苗，以MS為基本培養(yǎng)基，考察添加6BA（芐基腺嘌呤）、KT（激動素）、NAA（萘乙酸），對不定芽增殖的影響。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接3個，重復3次。30d后觀察組培苗的生長狀況，并統(tǒng)計各處理芽的分化率。

2.2.3 生根培養(yǎng)

以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的 IBA（吲哚乙酸）（0.1、0.2、0.3mg/L），接種 14d 觀察，30d統(tǒng)計配方生根情況。

2.2.4 培養(yǎng)條件

溫度 25±2 ℃，光照強度 3000 lx，12 h/d。

3 結果與分析

3.1 黑果枸杞無菌體系獲得

建立黑果枸杞無菌體系，使用單因素分別歸類進行成數(shù)統(tǒng)計分析，以枝條部位、酒精消毒時間、升汞消毒時間3個因素進行歸類分析結果見下表。

3.1.1 枝條不同部位處理對黑果枸杞啟動率的影響

表1 黑果枸杞枝條不同部位處理對啟動率的影響

表2 表1處理間差異分析

如表1所示，枝條不同部位滅菌成活率如下：枝條頂端＞枝條上部＞枝條中部＞枝條下部。根據(jù)表1的成活率，將平均成活率最高的枝條頂端成活株數(shù)和較高的枝條上部成活株數(shù)進行成數(shù)顯著性測定，見表 2， 結果如下：t=4.9179＞1.96差異顯著；t=4.9179＞2.58差異極顯著。二者呈極顯著差異，故采用枝條頂端為材料，成活率較高。

3.1.2 酒精消毒時間對黑果枸杞啟動率的影響

表3 酒精消毒時間對黑果枸杞啟動率的影響

表3所示，酒精消毒10s、20s、30s的處理組成活率高于酒精消毒40s的處理組，根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，將平均成活率最高的處理2和平均成活率較高的處理3進行成數(shù)顯著性測定，結果如表4：t=0.4472＜1.69，不顯著。根據(jù)表4，將平均成活率較低的處理1和平均成活率最低的處理4進行統(tǒng)計：t=8.2314＞1.96 差異顯著；t=8.2314＞2.58 差異極顯著。統(tǒng)計知滅菌10s、20s、30s的成活率之間差異不顯著。滅菌10s的比滅菌40s的差異極顯著。所以酒精消毒 10s、20s、30s都可以，以 10s最佳。

表4 表3處理間差異分析

表5 表3處理間差異分析

3.1.3 升汞消毒時間對黑果枸杞啟動率的影響

表6 升汞消毒時間對黑果枸杞啟動率的影響

表7 表6處理間差異分析

如表6所示，升汞消毒啟動率處理4＞處理3＞處理1＞處理2，將啟動率較高的處理4和處理3進行成數(shù)顯著性測定，見表7，結果如下：t=2.2395＞1.96，差異顯著。滅菌16分鐘顯著優(yōu)于滅菌12分鐘，更顯著優(yōu)于4和8分鐘滅菌的效果。

綜上所分析，綜合應用較好的理論組合應該是：采用枝條頂端+酒精滅菌10秒鐘+升汞滅菌16分鐘，實際結果該組合的成活率達到84.4%，符合理論結論。所以，該組合是最佳組合。

3.2 不同激素配比對增殖的影響

表8 不同激素配比對黑果枸杞增殖的影響

根據(jù)表8可看出，處理1增殖系數(shù)最高為5.89，且與其它實驗號差異顯著，但是該處理玻璃化現(xiàn)象嚴重，有效不定芽數(shù)少。比較各處理間增殖系數(shù)，分裂素使用KT的組合比6BA的組合更穩(wěn)定，處理 6、7、8、9 增殖系數(shù)為 3.83、3.67、3.7、2.2， 各處理間差異不顯著，但以使用激素濃度小，增殖系數(shù)大為佳，所以篩選MS+KT0.2mg/L+NAA0.02mg/L為最優(yōu)配方。

3.3 不同培養(yǎng)基和不同激素組合對生根的影響

本處理使用成數(shù)分析法分析，編號3、B、C與其他處理間差異顯著，3個處理間差異不顯著。具體表現(xiàn)形式為生根率較高，且側根和平均每株根數(shù)較多。由上表可看到，以1/2MS和MS作為基礎培養(yǎng)基的兩類生根培養(yǎng)基，生根率隨IBA質量濃度的增加呈遞增趨勢。IBA濃度為0.3mg/L時黑果枸杞的生根率最高，為73.3%和74.1%,IBA濃度為0.2mg/L和0.1mg/L時，生根率1/2MS＞MS。說明基礎培養(yǎng)基使用1/2MS效果較好。綜合以上，篩選出生根配方使用1/2MS為基本培養(yǎng)基中添加0.2～0.3mg/L的I-BA生根效果最佳。

4 討論

本研究確定了無菌體系獲得最佳條件為選用枝條頂端、酒精滅菌10秒鐘、升汞滅菌16分鐘。不同位置莖段位置啟動率差異較大，一般選擇幼嫩部位作為啟動材料。此外，大田中材料帶菌較多，可通過一段時間的室內培養(yǎng)再進行避免。日常培養(yǎng)時為避免材料浪費可在培養(yǎng)基中添加一定濃度的農用殺菌劑既能有效防止真菌污染，又能在一定程度上促進組培苗生長發(fā)育[2]。

黑果枸杞叢生芽增殖最 適合培養(yǎng)基為MS+KT0.2mg/L+NAA0.02mg/L，將分化系數(shù)控制在4以內，苗壯且無玻璃化現(xiàn)象。孫曉紅[3]研究發(fā)現(xiàn)，增殖最佳分裂素為ZT，葉片愈傷誘導使用分裂素6BA，且隨分裂素濃度升高，分化率增加，玻璃化增加，有效不定芽數(shù)減少，本研究中增殖時使用6BA也出現(xiàn)了嚴重的玻璃化現(xiàn)象。

馬彥軍[4]研究發(fā)現(xiàn)黃果枸杞組培快繁時發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基效果最佳，Siyu SUN等研究黑果枸杞組培發(fā)現(xiàn)生根培養(yǎng)時使用IBA生根率較高[5]，與本研究結果一致，最后獲得最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS為基本培養(yǎng)基中添加0.2～0.3mg/L的IBA。

表9 不同培養(yǎng)基和不同激素組合對生根的影響

［1］劉王鎖.產業(yè)化種植黑果枸杞的可行性分析［J］.林業(yè)通訊,2015，(2):31-32,40.

［2］李曉鶯,羅青,張曦燕,等.殺菌劑對枸杞組織培養(yǎng)中真菌污染的控制作用 ［J］.安徽農業(yè)科學,2008，(36):15804,15841.

［3］孫曉紅,位書磊,宋強,等.黑果枸杞的葉片分化與快速繁殖［J］.植物生理學報 2016,52(5):653-658.

［4］馬彥軍,楊萬鵬,楊坤,等.黃果枸杞愈傷組織誘導及快繁技術研究［J］.干旱區(qū)資 源與環(huán)境,2017,31(6):179-184.

［5］Siyu SUN,Hounan CAO,Hang YAO.Study on Tissue Culture and Rapid Propagation of Lycium ruthenicum Murr.［J］.Agricultural Science&Technology,2016,17(5):1060-1064.