洋蔥AcPME基因的克隆及序列分析

孫亞玲++陳立++孫雨晴++楊妍妍++吳雄++曹辰興++霍雨猛

摘要：以洋蔥花蕾為試材，通過(guò)RACE試驗(yàn)獲得了AcPME基因的全長(zhǎng)cDNA序列，GenBank登錄號(hào)為JF913196.1。該基因DNA序列包含2 786個(gè)堿基，4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，cDNA序列長(zhǎng)度為2 228 bp，編碼序列長(zhǎng)度為2 001 bp，編碼666個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示AcPME蛋白存在明顯的信號(hào)肽和跨膜區(qū)域（SP/TM）、PMEI結(jié)構(gòu)域和PME結(jié)構(gòu)域，在PME家族分類中屬于第Ⅰ類，即含有一個(gè)長(zhǎng)的N末端前區(qū)域（PRO-region）。氨基酸同源比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，AcPME蛋白與水稻、玉米、高粱等單子葉植物的同源蛋白具有較高的一致性。三維結(jié)構(gòu)模式圖顯示該蛋白具有一個(gè)明顯的凹溝，4個(gè)果膠結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基（T423、Q453、R565和W567），2個(gè)活性位點(diǎn)氨基酸殘基（D476和D497）。本研究為洋蔥AcPME基因的結(jié)構(gòu)域蛋白互作及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：洋蔥；果膠甲酯酶（PME）；克??；序列分析

中圖分類號(hào)：S633.201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）06-0007-07

AbstractThe sequence of AcPME gene was obtained through rapid amplification of cDNA ends （RACE） based on the sample of onion flower bud. The GenBank accession number was JF913196.1. The AcPME genomic DNA consisted of 2 786 bases with 4 exons and 3 introns. The cDNA length was 2 228 bp with a 2 001 bp ORF and encoded 666 amino acids. The bioinformatic analysis showed that the AcPME protein consisted of a signal peptide and transmembrane domain （SP/TM）， a PMEI structural domain and a PME structural domain， which belonged to type I with a long N terminal PRO-region in the PME families. The amino acid homologous alignment and phylogenetic tree analysis exhibited that there were higher identities between AcPME and PME of homologous monocotyledons such as rice， maize and sorghum. The three-dimensional structure map showed AcPME protein had an obvious shallow cleft， 4 amino acid residues （T423， Q453， R565 and W567） binding to substrate and 2 residues （D476 and D497） involved in catalysis. The research laid a foundation for the biological functions of AcPME protein and the interactions between PMEI and PME domains.

KeywordsOnion； Pectin methylesterase （PME）； Cloning； Sequence analysis

果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）是催化果膠復(fù)合物中甲酯化的D-半乳糖醛酸單元去甲酯化的一類細(xì)胞壁蛋白，根據(jù)其保守的結(jié)構(gòu)域該酶組成了一個(gè)巨大的基因家族。在分類上依據(jù)其N端前區(qū)域的長(zhǎng)短及有無(wú)，分為兩種類型，Type Ⅰ和Type Ⅱ，它們?cè)谥参锊煌纳L(zhǎng)發(fā)育階段及不同生理過(guò)程中通過(guò)作用于細(xì)胞壁而發(fā)揮作用[1]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，果膠甲酯酶參與了多種生理過(guò)程，如果實(shí)成熟、器官脫落、小孢子發(fā)育、花粉管伸長(zhǎng)、種子萌發(fā)、抗病性、形成層細(xì)胞分化等[2-5]。

植物花粉管的發(fā)育是植物生殖發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，花粉管壁和其他部位的細(xì)胞壁不同，由單層果膠組成，沒(méi)有纖維素和胼胝質(zhì)等成分，所以果膠甲酯酶基因在花粉和花粉管的生長(zhǎng)發(fā)育中至關(guān)重要[6]。在擬南芥花藥發(fā)育過(guò)程中，約有20 000個(gè)基因在花粉中表達(dá)，但其中僅有約10%的基因?yàn)榛ǚ厶禺愋员磉_(dá)[7]。迄今為止，研究者們已對(duì)油菜[8]、矮牽牛[9]、玉米[10]、紫花苜蓿[11，12]、亞麻[13]、煙草[14]、擬南芥[15]和白菜[16，17]等植物的花或花粉特異表達(dá)的PME基因進(jìn)行了研究。

本課題組在研究洋蔥育性相關(guān)基因差異表達(dá)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大小約為350 bp的片段始終只在可育材料中出現(xiàn)[18]。我們回收測(cè)序此片段，并做序列比對(duì)結(jié)果顯示，該基因片段編碼蛋白具有果膠甲酯酶結(jié)構(gòu)域，屬于果膠甲酯酶超家族成員，該片段代碼為AcPME3031（GenBank Accession GU384209）。本研究以洋蔥AcPME基因部分片段GU384209為切入點(diǎn)，通過(guò)RACE試驗(yàn)獲得AcPME基因的全長(zhǎng)cDNA序列，以利對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析研究。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

洋蔥育性恢復(fù)系12-10（S， MsMs）花蕾采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)基地，用液氮速凍后，儲(chǔ)存于-80℃超低溫冰箱中。