偏側(cè)咀嚼致大鼠咬肌肌纖維代謝特征改變及其腺苷酸活化蛋白激酶調(diào)節(jié)機(jī)制

石安迪曾林劉靜

1.暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.口腔修復(fù)學(xué)教研室，廣州 510632

偏側(cè)咀嚼致大鼠咬肌肌纖維代謝特征改變及其腺苷酸活化蛋白激酶調(diào)節(jié)機(jī)制

石安迪1曾林1劉靜2

1.暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；2.口腔修復(fù)學(xué)教研室，廣州 510632

目的 探討偏側(cè)咀嚼對(duì)大鼠咬肌肌纖維代謝特征的影響及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）對(duì)肌纖維代謝特征變化的調(diào)控作用。方法 拔除大鼠右上頜磨牙建立偏側(cè)咀嚼大鼠模型，實(shí)驗(yàn)組分為2、4、6、8周組，設(shè)同期對(duì)照組。應(yīng)用輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶（NADH-TRase）染色法檢測(cè)咬肌肌纖維有氧代謝類(lèi)型以及各型肌纖維的分布密度和構(gòu)成比；用Western blot技術(shù)檢測(cè)p-AMPK（Thr172）/AMPKα1表達(dá)水平。結(jié)果 與同期對(duì)照組比較，建模2周實(shí)驗(yàn)組拔牙側(cè)深染型肌纖維比例增多，非拔牙側(cè)中染型纖維比例增加，淺染型肌纖維比例減少（P<0.05）；建模4、6、8周組雙側(cè)深染型肌纖維比例持續(xù)增加，拔牙側(cè)顯著高于非拔牙側(cè)；第6、8周組雙側(cè)中染型肌纖維比例下降（P<0.05）；拔牙側(cè)淺染肌纖維比例在8周組減少，非拔牙側(cè)無(wú)明顯改變（P>0.05）。p-AMPK（Thr172）/AMPKα1表達(dá)水平在2、4周拔牙側(cè)較對(duì)照組和非拔牙側(cè)增高（P<0.05），在非拔牙側(cè)各周組無(wú)顯著改變（P>0.05）。結(jié)論 偏側(cè)咀嚼可促進(jìn)雙側(cè)咬肌肌纖維有氧代謝能力且伴隨表型特征的改變，在非工作側(cè)更明顯；肌纖維有氧代謝能力增強(qiáng)與AMPK通路的激活有關(guān)。

輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶； 腺苷酸活化蛋白激酶； 氧化代謝； 偏側(cè)咀嚼

偏側(cè)咀嚼是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular disorder，TMD）的致病因素之一[1]，也是臨床上常見(jiàn)的咬合紊亂[2]。有研究[3-4]已指出偏側(cè)咀嚼可以導(dǎo)致雙側(cè)咀嚼肌結(jié)構(gòu)和肌電發(fā)生改變。而此不良咀嚼習(xí)慣是否會(huì)通過(guò)激活細(xì)胞通路導(dǎo)致咀嚼肌肌纖維耐疲勞性改變尚不明確。輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶（nicotine adenine dinucleotide tetrazolium reductase，NADH-TRase）是線粒體呼吸鏈中的遞氫體之一，是肌纖維有氧代謝能力和肌抗疲勞性的重要指標(biāo)。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是細(xì)胞內(nèi)重要能量感受器，調(diào)控肌纖維能量代謝和肌纖維表型。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立偏側(cè)咀嚼大鼠模型，了解偏側(cè)咀嚼對(duì)雙側(cè)咬肌肌纖維耐疲勞性的影響和AMPK信號(hào)通路在咬肌肌纖維改建中的作用，探討偏側(cè)咀嚼導(dǎo)致的咀嚼肌功能紊亂致病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和分組

選取由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的8周齡SD雄性大鼠40只，體重200~250 g，許可證號(hào)：SCXK（粵）2011-0015。所有大鼠口內(nèi)檢查上下牙列完整，咬合關(guān)系基本正常。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型 將40只SD雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別于建模2、4、6和8周后進(jìn)行樣品采集，每組又分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各5只。實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（0.004 m L·g-1）腹腔注射麻醉后，呈仰臥位固定于手術(shù)板上，以探針?lè)蛛x右上頜磨牙牙齦，止血鉗拔除右側(cè)上頜所有磨牙。對(duì)照組大鼠不拔牙，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 樣本制取 大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于工作臺(tái)，心尖灌注生理鹽水完全置換血液，雙側(cè)咬肌部位備皮，分離、暴露并取出咬肌組織，取雙側(cè)咬肌前部約0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小的組織塊依次放入4 ℃預(yù)冷的20%蔗糖PB緩沖液和30%蔗糖PB緩沖液中至組織沉底以梯度脫水。另取40 mg放入裂解液中（含苯甲基磺酰氟和蛋白磷酸酶抑制劑）在勻漿器中勻漿3 min，后靜置冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心10 m in，吸取上清液。

1.2.3 咬肌切片和染色 取組織塊稍修整，使肌纖維方向垂直于底座，OCT包埋劑包埋，于-22 ℃恒冷箱切片機(jī)中進(jìn)行冰凍切片，片厚16 μm，室溫晾干，進(jìn)行NADH-TRase染色。在Leica正立電動(dòng)顯微鏡下觀察肌纖維的染色情況。在200倍光鏡下觀察，每張組織切片隨機(jī)選10個(gè)視野，采用Image-ProPlus 6.0全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)各型肌纖維進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算各種類(lèi)型纖維占肌纖維總數(shù)的百分率。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 上清液進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)液蛋白濃度定量后加入6×十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液，沸水加熱5 m in。上樣，SDS-PAGE電泳，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部停止電泳。切取相應(yīng)部位的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，由下至上按海綿墊、3層濾紙、凝膠、NC膜、3層濾紙、海綿墊放好（NC膜提前5 m in完全浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中）。夾緊轉(zhuǎn)膜的夾子，按正負(fù)極放入轉(zhuǎn)膜盒中，并置入冰盒，調(diào)節(jié)電流350 mA轉(zhuǎn)膜60 min后停止。NC膜在TBST中清洗3遍后置入5%BSA封閉液中室溫下封閉60 m in，用TBST洗3次（每次5 m in），加入抗AMPKα1（武漢博士德生物工程有限公司）、抗p-AMPK（Thr172）單克隆抗體（1︰500稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，棄一抗，在搖床上用TBST洗3次（每次10 m in），加入羊抗兔、羊抗小鼠（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）二抗工作液（1︰5 000稀釋?zhuān)覝叵聯(lián)u床孵育60 m in，用TBST洗4次（每次8 m in）。加入超敏化學(xué)發(fā)光液（enhanced chem ilum inescence，ECL）顯影，記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)組和同期對(duì)照組均數(shù)用t檢驗(yàn)，各周實(shí)驗(yàn)組組間用SNK檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 咬肌肌纖維NADH-TRase染色結(jié)果

NADH-TRase染色后肌纖維呈藍(lán)色或紫藍(lán)色，根據(jù)著色程度可以分為深染、中染及淺染肌纖維。正常大鼠咬肌淺部及中部主要分布有淺染和中染肌纖維，分別約占33%、46%。深部散在分布深染肌纖維，約占21%。各組大鼠咬肌各型肌纖維NADHTRase染色結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

表 1 各組大鼠咬肌各型肌纖維NADH-TRase染色的構(gòu)成比Tab 1 Masseter muscle fiber composition in the rats revealed by NADH-TRase staining in each group %,?±s

圖 1 偏側(cè)咀嚼大鼠咬肌肌纖維型 NADH-TRase染色 × 200Fig 1 Masseter muscle fiber type of unilateral chew ing rats NADH-TRase staining × 200

各周實(shí)驗(yàn)組拔牙側(cè)深染肌纖維含量較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組非拔牙側(cè)高（P<0.05），并有逐漸上升趨勢(shì)。在建模4、8周，實(shí)驗(yàn)組非拔牙側(cè)深染肌纖維含量較對(duì)照組均有所增高（P<0.05）。2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組非拔牙側(cè)中染肌纖維比例較對(duì)照組增高，其余各周實(shí)驗(yàn)組大鼠雙側(cè)咬肌均較對(duì)照組減少（P<0.05）。各周實(shí)驗(yàn)組拔牙側(cè)淺染肌纖維比例逐漸下降，于8周組達(dá)最低。在非拔牙側(cè)，建模后的淺染肌纖維含量先下降后回升，建模6、8周淺染肌纖維含量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 咬肌p-AMPK（Thr172）/AMPKα1蛋白表達(dá)水平的變化

根據(jù)灰度值分析，實(shí)驗(yàn)組拔牙側(cè)咬肌p-AMPK（Thr172）/AMPKα1的表達(dá)在建模初期2、4周的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著增高（P<0.05），而建模后期6、8周組則逐漸減少，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而實(shí)驗(yàn)組非拔牙側(cè)p-AMPK（Thr172）/ AMPKα1的表達(dá)則在4、6、8周高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2、表2）。

圖 2 Western blot檢測(cè)AMPKα1、p-AMPK（Thr172）蛋白表達(dá)情況Fig 2 Protein expression of AMPKα1 and p-AMPK(Thr172) by Western blot

表 2 各周偏側(cè)咀嚼大鼠咬肌p-AM PK（Thr172）/AMPKα1的相對(duì)表達(dá)量Tab 2 Relative expression of p-AMPK(Thr172)/AM PKα1 in m asseter m uscle fiber of unilateral chew ing rats in each group

3 討論

3.1 偏側(cè)咀嚼導(dǎo)致有氧代謝能力的變化

研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期偏側(cè)咀嚼可以導(dǎo)致工作側(cè)咀嚼肌疼痛[5]、頭痛[6]，肌電檢測(cè)雙側(cè)咬肌肌電圖表現(xiàn)不一致[7]。在青少年時(shí)期偏側(cè)咀嚼還可影響面部發(fā)育，導(dǎo)致臉部發(fā)育不對(duì)稱(chēng)[8]。另外工作側(cè)的髁突受到的壓力更大，偏側(cè)咀嚼的工作側(cè)關(guān)節(jié)負(fù)擔(dān)大[9]。口頜系統(tǒng)正常功能的行使有賴于肌肉、關(guān)節(jié)、咬合的協(xié)調(diào)，而肌肉作為動(dòng)力來(lái)源，在出現(xiàn)咬合干擾后理論上應(yīng)較髁突、關(guān)節(jié)盤(pán)先出現(xiàn)改建。

咀嚼肌機(jī)械收縮能力又受到肌纖維代謝方式的影響，有氧代謝能力越強(qiáng)肌纖維的抗疲勞性越好。NADH-TRase作為線粒體呼吸鏈中的脫氫酶，對(duì)細(xì)胞有氧代謝能力起重要指示作用[10]。肌纖維染色越深，有氧代謝能力和耐力越強(qiáng)，抗疲勞性越好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)建模2周組，非拔牙側(cè)中染肌纖維和拔牙側(cè)深染肌纖維出現(xiàn)明顯增加，說(shuō)明咬合干擾對(duì)肌纖維有氧代謝能力的調(diào)整在早期即可出現(xiàn)。為了適應(yīng)增加的咬合負(fù)擔(dān)，功能側(cè)咬肌通過(guò)增加混合供能的肌纖維，既增加了肌收縮力又增強(qiáng)了耐力。隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，第4、6、8周雙側(cè)深染肌纖維逐漸增高，并且拔牙側(cè)顯著高于非拔牙側(cè)，說(shuō)明長(zhǎng)期偏側(cè)咀嚼導(dǎo)致雙側(cè)咬肌氧化代謝能力增加，肌抗疲勞性增加。Douglas等[11]指出咬合干擾是一種運(yùn)動(dòng)單位病理性改變。當(dāng)只有一側(cè)磨牙進(jìn)行咀嚼，為適應(yīng)增加的咀嚼負(fù)擔(dān)，咀嚼肌通過(guò)上調(diào)雙側(cè)咬肌有氧代謝為主的肌纖維，增加抗疲勞性，進(jìn)而增加咀嚼循環(huán)進(jìn)食，這與Honma等[12]的研究結(jié)果相符。但是非拔牙側(cè)的增加幅度小于拔牙側(cè)。胡敏等[13]研究也發(fā)現(xiàn)一側(cè)后牙缺失的小型豬雙側(cè)咬?、裥图±w維增多，其中以拔牙側(cè)增加更明顯，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

本研究在建模8周，拔牙側(cè)淺染肌纖維開(kāi)始出現(xiàn)減少，說(shuō)明在拔牙側(cè)由于 干擾持續(xù)存在，糖酵解供能為主的肌纖維也將向有氧代謝供能類(lèi)型肌纖維轉(zhuǎn)化，Scribbans等[14]研究也指出長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致各型肌纖維有氧代謝能力增高。而非拔牙側(cè)淺染肌纖維逐漸恢復(fù)，這與口腔內(nèi)的感受器反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。在建模開(kāi)始時(shí)為了適應(yīng)新的咬合關(guān)系，咬肌通過(guò)增加中染肌纖維比例，以更高效率粉碎食物，但是由于功能側(cè)有咬合接觸，通過(guò)牙周膜、肌梭感受器的調(diào)節(jié)，肌纖維代謝能力和肌力恢復(fù)正常咬合狀態(tài)，因而各型肌纖維有逐漸恢復(fù)原比例的趨勢(shì)。

3.2 AMPK磷酸化與肌纖維表型關(guān)系

肌纖維的表型和代謝能力受到細(xì)胞因子的調(diào)控。AMPK是近年來(lái)備受關(guān)注的細(xì)胞內(nèi)敏感能量感受器。當(dāng)胞內(nèi)能量大量消耗導(dǎo)致一磷酸腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）︰三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）︰ATP的比例增高和胞內(nèi)Ca2+增高時(shí)可刺激AMPK磷酸化，并通過(guò)激活下游調(diào)控因子氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferater activated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α），促進(jìn)線粒體生成、慢肌的轉(zhuǎn)錄[15]。同時(shí)還有促進(jìn)胞內(nèi)葡萄糖攝取、抑制蛋白合成，調(diào)控離子通道的作用[15-16]。

王曉慧等[17]研究發(fā)現(xiàn)拔牙側(cè)AM PK下游分子PGC-1α的mRNA表達(dá)量在偏側(cè)咀嚼建模2、4、8周組明顯高于非拔牙側(cè)及對(duì)照組。本研究顯示拔牙側(cè)AMPK磷酸化程度在2、4周組分別是正常對(duì)照組的1.5、1.3倍，與先前研究結(jié)果相符，提示非工作側(cè)由于拔牙后喪失咬合接觸，在新的咀嚼模式下，下頜活動(dòng)度在咬合干擾初期增大，導(dǎo)致肌纖維內(nèi)能量大量消耗，當(dāng)引起AMP︰ATP比例下降后激活更多的AMPKα1磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)慢肌的轉(zhuǎn)化、線粒體的合成，因而AMPK磷酸化程度在拔牙側(cè)與深染肌纖維的增加有一致性。但也有不一致的地方，拔牙側(cè)深染肌纖維逐漸增加而AMPK磷酸化程度在6、8周組咬肌并沒(méi)明顯增加，這可能是由于建模早期肌纖維內(nèi)線粒體增加，有氧代謝能力改善，在建模后期胞內(nèi)能量補(bǔ)充及時(shí)，所以未導(dǎo)致AMP︰ATP的改變。另外和其他通路的調(diào)節(jié)也有關(guān)。王子?jì)沟萚18]研究也發(fā)現(xiàn)偏側(cè)咀嚼大鼠咬肌CaN在咬肌肌纖維內(nèi)的變化和Ⅰ型肌纖維的增加有關(guān)。在非拔牙側(cè)AMPK磷酸化在各周均無(wú)明顯增高，分析其原因可能有兩點(diǎn)：1）由于非拔牙側(cè)保持原有咬合接觸，咀嚼肌運(yùn)動(dòng)幅度并未明顯增加，肌纖維內(nèi)能量消耗并沒(méi)有明顯增多，AMP︰ATP比例未改變；2）本實(shí)驗(yàn)樣本量不足，未得出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因而非拔牙側(cè)深染型肌纖維比例雖較對(duì)照組增大，但增加幅度較拔牙側(cè)小。

綜上所述，本研究通過(guò)建立大鼠模型證明偏側(cè)咀嚼對(duì)雙側(cè)咬肌有氧代謝和抗疲勞性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致雙側(cè)咬肌有氧代謝能力逐漸增強(qiáng)，并且雙側(cè)改變不一致，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，這種改變可能與AMPK磷酸化程度激活有關(guān)。

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（本文編輯 杜冰）

Alteration of metabolic characteristics on the masseter muscle fiber of unilateral chew ing rats and its adenosine mono-

phosphate activated protein kinase regulatory mechanism

Shi Andi1, Zeng Lin1, Liu Jing2. (1. College of Stomatology,

Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Dept. of Prosthodontics, College of Stomatology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Supported by: Talent Fund of Jinan University(51025036). Correspondence: Liu Jing, E-mail: lxxjing98@sina.com.

ObjectiveThis study aims to determ ine the influence of unilateral chew ing on metabolic characteristics of masseter muscle fibers in rats and the regulatory effect of an adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) signal pathway on metabolism.MethodsRats were subm itted to exodontia of all the right maxillary molars and divided into 2, 4, 6, and 8 weeks groups, and corresponding control groups were set as well. Sections were stained by nicotine adenine dinucleotide tetrazolim reductase(NADH-TRase) to demonstrate the types, proportion, and density of masseter muscle fibers. AMPKα1 and p-AMPK(Thr172) levels in bilateral masseter muscles were detected by Western blot.ResultsIn the 2-week group, the percentage of dark fibers augmented in the ipsilateral side, whereas the percentage of intermediary fibers in the contralateral side was increased accompanied by a decrease of light fibers, compared with the control group (P<0.05). The percentage of dark fibers was increased in the bilateral sides, whereas the percentage of dark fiber in the ipsilateral sides surpassed that of the contralateral sides in the 4, 6, and 8-week groups. The percentage of intermediary fibers was decreased in the bilateral sides in the 6 and 8-week groups (P<0.05). The percentage of light fibers was reduced in the ipsilateral sides in the 8-week group, whereas no alteration was observed in contralateral sides (P>0.05). In the ipsilateral sides, p-AMPK (Thr172)/AMPKα1 levels were increased in the 2 and 4-week groups (P<0.05), whereas no change was observed in the contralateral sides in either group (P>0.05).ConclusionUnilateral chew ing increases the oxidative metabolic ability in bilateral masseter muscle fibers especially in the non-working side accompanied with change of muscle fiber types. Theimprovement of aerobic metabolism ability is related to the AMPK signal pathway.

nicotine adenine dinucleotide tetrazolium reductase; adenosine monophosphate activated protein kinase; oxidative metabolism; unilateral chew ing

Q 257

A

10.7518/hxkq.2017.03.006

2016-06-22；

2017-03-10

暨南大學(xué)優(yōu)秀人才基金（51025036）

石安迪，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：505256764@qq.com

劉靜，教授，碩士，E-mail：lxxjing98@sina.com