復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者可溶性程序性死亡受體1及可溶性程序性死亡配體1表達(dá)與免疫功能的相關(guān)性

江南 羅亮 劉莉 孫小琴 姜星 蔡揚(yáng)

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，貴陽 550004

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者可溶性程序性死亡受體1及可溶性程序性死亡配體1表達(dá)與免疫功能的相關(guān)性

江南 羅亮 劉莉 孫小琴 姜星 蔡揚(yáng)

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，貴陽 550004

目的 了解復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍（RAU）患者血清中可溶性程序性死亡受體-1（sPD-1）、可溶性程序性死亡配體-1（sPD-L1）蛋白表達(dá)與患者免疫功能狀態(tài)的相關(guān)性，探討sPD-1/sPD-L1在RAU免疫發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。方法 研究對象為30例RAU患者（輕型18例，重型5例，皰疹型7例）及18例健康人（對照組）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測RAU患者外周血細(xì)胞免疫指標(biāo)（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+），散射比濁法檢測RAU患者體液免疫指標(biāo)（IgG、IgA、IgM、C3、C4），酶聯(lián)免疫吸附測定RAU患者及健康人血清中sPD-1、sPD-L1蛋白表達(dá)，并對sPD-1、sPD-L1表達(dá)水平與RAU患者免疫功能狀況及臨床特征的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果 與正常值相比，RAU患者CD4+水平降低，IgM水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達(dá)水平高于對照組（P<0.05）；進(jìn)一步分析表明，輕型、重型RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達(dá)水平高于對照組（P<0.05），而皰疹型RAU患者與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。RAU患者sPD-1表達(dá)量與CD19+、C4存在正相關(guān)關(guān)系（r1= 0.389，P1=0.034；r2=0.382，P2=0.037）。結(jié)論 RAU患者以細(xì)胞免疫功能低下為主，同時(shí)伴有體液免疫功能的紊亂；RAU患者sPD-1、sPD-L1蛋白高表達(dá)在一定程度上通過影響PD-1/PD-L1信號通路參與RAU免疫機(jī)制的調(diào)節(jié)，可能在RAU的免疫發(fā)病機(jī)制中起著一定作用。

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍； 可溶性程序性死亡受體1； 可溶性程序性死亡配體1； 免疫

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍（recurrent aphthous ulcer，RAU）是最常見的口腔黏膜疾病，臨床表現(xiàn)為口腔黏膜上周期性復(fù)發(fā)性的潰瘍性損害。RAU的發(fā)病與遺傳、免疫、環(huán)境、感染等多種因素有關(guān)，其中免疫因素被認(rèn)為與該病的發(fā)生尤為密切[1]，但具體發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）為免疫抑制分子，屬于CD28家族成員的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表達(dá)于外周CD4+、CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞及其樹突狀細(xì)胞表面，PD-1在無功能的T細(xì)胞上也呈高表達(dá)[2]。PD-1可抑制B細(xì)胞受體的刺激性信號，從而降低B細(xì)胞活化[3]。程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）是PD-1的配體，屬于B7超家族成員，廣泛表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞，以及樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)的骨髓來源的肥大細(xì)胞[4]。PD-L1的生物學(xué)作用為通過與PD-1分子結(jié)合，并活化其胞內(nèi)段ITIM基序，傳遞正向信號，負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化和功能。PD-1/PD-L1是目前免疫學(xué)分子領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，其可以協(xié)助激活T細(xì)胞，又可以通過負(fù)性協(xié)同刺激信號下調(diào)免疫反應(yīng)。近期研究表明，PD-1、PD-L1除了膜結(jié)合型外，還存在可溶性形式，即：可溶性PD-1（soluble programmed death-1，sPD-1）和可溶性PD-L1（soluble programmed death ligand 1，sPD-L1）。研究發(fā)現(xiàn)，sPD-1能高親和力結(jié)合PD-L1，阻斷PD-L1/PD-1的相互作用，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)[5]；sPD-L1則可與T細(xì)胞表面PD-1受體相結(jié)合負(fù)性調(diào)控T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，抑制T細(xì)胞增殖[6]。它們在多種免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。目前已有新藥CT-011和MDX-1106通過阻斷PD-1而實(shí)現(xiàn)了對PD-L1/PD-1相互作用的抑制，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)來達(dá)到抗腫瘤的效果[7]。

本研究通過了解RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1蛋白表達(dá)情況，并分析其與RAU患者免疫功能狀態(tài)的相關(guān)性，探討sPD-1/sPD-L1在RAU免疫發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

病例選自2012年9月—2013年9月間就診于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科黏膜病?？崎T診初診為RAU的患者30例（RAU組）。其中，男性14例，女性16例；年齡16~72歲，平均年齡（44.03±1.58）歲。按RAU的臨床分型標(biāo)準(zhǔn)[1]，其中輕型18例，重型5例，皰疹型7例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合RAU臨床診斷（參考衛(wèi)生部規(guī)劃教材《口腔黏膜病學(xué)》 第 4 版）；2）潰瘍頻繁發(fā)作病史半年以上（潰瘍復(fù)發(fā)頻率每月至少 1 次）；3）本次潰瘍發(fā)作不超過 72 h，并未進(jìn)行過局部及全身治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）患者1 個(gè)月內(nèi)使用過抗生素，3個(gè)月內(nèi)使用過免疫制劑；2）伴有全身系統(tǒng)性疾病（糖尿病、心血管疾病、肝炎、精神病等）或免疫性疾病者；3）有牙齦炎、牙周炎或其他口腔黏膜疾病者；4）月經(jīng)期、妊娠期婦女。

對照組18例，均為來自于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心的年齡、性別與RAU組匹配的健康人。

所有的研究對象均被告知研究內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 主要設(shè)備及試劑

流式細(xì)胞儀、6色TBNK檢測試劑盒（BD公司，美國），特定蛋白分析系統(tǒng)（Beckman Coulter公司，美國），酶標(biāo)儀（BIO-RAD公司，美國 ），免疫球蛋白G/A/M檢測試劑盒、補(bǔ)體C3/C4 檢測試劑盒（貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)蘇州有限公司），人sPD-1、sPD-L1酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海創(chuàng)祥生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫檢測 采集RAU組患者空腹?fàn)顟B(tài)下清晨9點(diǎn)前外周靜脈血兩管，一管抗凝血（3 m L）送至貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者外周血細(xì)胞免疫指標(biāo)（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+）；另一管非抗凝血（5 m L）送至貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院微生物免疫實(shí)驗(yàn)室，采用散射比濁法檢測患者體液免疫指標(biāo)（IgG、IgA、IgM、C3、C4），收集上清夜-80 ℃凍存?zhèn)溆茫加上鄳?yīng)實(shí)驗(yàn)室完成。以實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)值為正常對照。1.3.2 sPD-1、sPD-L1蛋白表達(dá) 采用ELISA檢測RAU組患者及對照組健康人血清中sPD-1和sPD-L1水平，按照說明書進(jìn)行操作。sPD-1、sPD-L1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度依次為0、15、30、60、120、240 pg·m L-1。以空白孔調(diào)零，利用酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度（A）值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測血清中sPD-1和sPD-L1的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，資料統(tǒng)計(jì)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)（四分位間距）表示，兩組之間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，sPD-1、sPD-L1表達(dá)水平與RAU患者免疫功能狀況及臨床特征的相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫檢測結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，RAU組患者CD4+水平低于正常值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）；散射比濁法檢測結(jié)果表明，RAU患者IgM水平高于正常值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表 1 RAU患者細(xì)胞免疫檢測結(jié)果Tab 1 Cellular immune test results in patients with RAU

2.2 sPD-1、sPD-L1蛋白的表達(dá)情況

ELISA檢測結(jié)果（圖1）表明，對照組sPD-1、sPD-L1分布較為集中，未見極端值，整體呈正態(tài)性分布趨勢；RAU組sPD-1、sPD-L1整體呈非正態(tài)性分布，其中30例中有3例（2例輕型、1例皰疹型）升高趨勢較為明顯，RAU患者外周血血清中sPD-1、sPD-L1表達(dá)水平較對照組總體上表現(xiàn)為升高趨勢，但個(gè)體之間存在著差異。秩和檢驗(yàn)分析表明，RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z1=-2.794，P1=0.005；Z2=-2.834，P2=0.005）。

表 2 RAU患者體液免疫檢測結(jié)果Tab 2 Humoral immune test results in patients with RAU

圖 1 RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1蛋白的表達(dá)Fig 1 Expression of sPD-1, sPD-L1 protein in patients with RAU

進(jìn)一步分析RAU不同臨床類型間的sPD-1及sPDL1的表達(dá)，結(jié)果顯示輕型、重型RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而皰疹型RAU患者與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表3）。

表 3 不同臨床類型RAU患者血清中sPD-1及sPD-L1蛋白的表達(dá)水平Tab 3 Expression level of sPD-1, sPD-L1 protein in RAU patients with different clinical features pg·m L-1

2.3 RAU患者sPD-1、sPD-L1表達(dá)量與免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析表明，RAU患者sPD-1表達(dá)量與CD19+、C4存在正相關(guān)關(guān)系（r1=0.389，P1=0.034；r2=0.382，P2=0.037）；但sPD-L1表達(dá)量與細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)均無相關(guān)關(guān)系（表4）。

表 4 RAU患者sPD-1、sPD-L1與免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析T ab 4 The correlate analysis between the expression of sPD-1, sPD-L1 and the immune system of RAU patients

3 討論

RAU是最常見的口腔黏膜疾病，是一種局限口腔黏膜的潰瘍性損害，患病率20%左右[1]。RAU具有周期性、復(fù)發(fā)性、自限性、灼痛明顯等特點(diǎn)，給患者帶來了很大的痛苦。RAU的病因及發(fā)病機(jī)制不明，推測其發(fā)生可能是機(jī)體在受到各種可疑致病因素如細(xì)菌、病毒或精神心理因素、激素的改變、生活不規(guī)律等的刺激下引發(fā)的異常免疫反應(yīng)，致使口腔黏膜上皮局部發(fā)生免疫性的損傷、壞死而形成潰瘍。目前認(rèn)為RAU患者免疫調(diào)節(jié)失衡是其發(fā)生的重要原因。機(jī)體免疫中，T淋巴細(xì)胞亞群主管細(xì)胞免疫，是細(xì)胞免疫的主力軍[8]，其功能主要取決于T淋巴細(xì)胞總值（CD3+）及其亞群（CD4+、CD8+）的相對組成。在本研究中RAU患者以CD4+降低最為明顯，提示在RAU的發(fā)作期，患者的細(xì)胞免疫功能處于低下狀態(tài)，這與其他學(xué)者[9]的研究結(jié)果一致。免疫功能低下很可能會導(dǎo)致機(jī)體對外來致RAU的抗原或者是超抗原的抵御能力變?nèi)?。體液免疫是通過B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白來實(shí)現(xiàn)的，免疫球蛋白（Ig）可分為五類，即IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中，IgM在免疫球蛋白中相對分子質(zhì)量最大，是初次體液免疫應(yīng)答中抗感染的“先鋒部隊(duì)”，通過與補(bǔ)體結(jié)合，可起到溶解細(xì)菌和溶解血細(xì)胞的作用。C3、C4是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最多、最重要的一個(gè)組分。在本研究中，與正常值相比，RAU患者IgM升高，提示患者體液免疫功能處于增強(qiáng)狀態(tài)。以上結(jié)果提示RAU發(fā)作期機(jī)體免疫狀態(tài)是不正常的，不僅有細(xì)胞免疫的低下，而且還有體液免疫功能的增強(qiáng)。

協(xié)同刺激分子家族的新成員PD-1/PD-L1是目前免疫學(xué)分子領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)，PD-1/PD-L1共刺激信號通過抑制下游細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答，在維持免疫耐受中起重要作用[10-11]。正常生理調(diào)節(jié)下適量的PD-1/PD-L1信號通路能抑制T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的相互作用，限制自身反應(yīng)性T細(xì)胞效應(yīng)功能和靶器官的損害[12]，保護(hù)外周組織不受自身免疫對機(jī)體的攻擊；但如果PD-1/PD-L1通路提供的負(fù)信號強(qiáng)度過強(qiáng)，又會過度地抑制T細(xì)胞的增殖、活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能缺陷。sPD-1與PD-L1或者sPD-L1與PD-1結(jié)合都能夠影響PD-1/PD-L1信號通路，發(fā)揮免疫抑制作用。本研究結(jié)果顯示，RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1水平均高于正常。推測，一方面可能由于RAU患者體內(nèi)異常升高的sPD-1過多的與PD-L1結(jié)合阻斷了T淋巴細(xì)胞表面的PD-1與單核細(xì)胞、組織細(xì)胞等表面的PD-L1的結(jié)合，進(jìn)而活化的CD4+T細(xì)胞逃避了PD-1/PD-L1的負(fù)性調(diào)控信號，導(dǎo)致T細(xì)胞持續(xù)活化、增殖，對自身抗原產(chǎn)生持續(xù)的免疫應(yīng)答，發(fā)生自身組織損傷。另一方面可能由于RAU患者體內(nèi)sPD-L1的異常增多與PD-1發(fā)生結(jié)合，使得抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）細(xì)胞膜表面的PD-L1與T、B細(xì)胞表面的PD-1發(fā)生相互作用的頻率、概率顯著降低，進(jìn)而活化T細(xì)胞不能及時(shí)獲得足夠強(qiáng)度的負(fù)性調(diào)控信號，導(dǎo)致T細(xì)胞過度活化增殖，對自身抗原引起持續(xù)的免疫反應(yīng)，發(fā)生自身組織損傷[13]。本研究還進(jìn)一步分析了RAU不同臨床類型間的sPD-1及sPD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示，輕型、重型RAU的sPD-1及sPD-L1蛋白表達(dá)水平都高于對照組（P<0.05），而RAU皰疹型與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究皰疹型樣本量小有關(guān)。對RAU患者細(xì)胞免疫和體液免疫與sPD-1水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，sPD-1蛋白的高表達(dá)與RAU細(xì)胞免疫中CD19+、體液免疫中C4存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。加之上述免疫結(jié)果已經(jīng)表明，RAU細(xì)胞免疫中CD4+細(xì)胞減少，RAU患者處于細(xì)胞免疫功能低下狀態(tài)。這提示：sPD-1的高表達(dá)可能促使RAU患者的體液免疫功能增強(qiáng)。其原因可能是sPD-1能夠參與血液循環(huán)，它們既能夠影響鄰近細(xì)胞又能夠和遠(yuǎn)端細(xì)胞表面的受體相互結(jié)合，其發(fā)揮作用的廣度和深度甚至超過了細(xì)胞膜表面的分子。研究[14-15]表明sPD-L1促使細(xì)胞周期停滯于G1期并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡，這與本研究中RAU患者的實(shí)際免疫結(jié)果相符合。因此，sPD-1、sPD-L1分子可能都參與了RAU疾病的發(fā)生。

綜上所述，本研究中RAU患者以細(xì)胞免疫功能低下為主，同時(shí)還伴有體液免疫功能的增強(qiáng)，且外周血中sPD-1和sPD-L1蛋白表達(dá)水平增高。sPD-1的高表達(dá)與CD19+、C4存在正相關(guān)關(guān)系，說明sPD-1蛋白的表達(dá)異常，其可能在一定程度上通過影響PD-1/ PD-L1信號通路抑制RAU的細(xì)胞免疫，同時(shí)誘發(fā)RAU的體液免疫增強(qiáng)，在RAU免疫發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用，但其具體的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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（本文編輯 李彩）

Soluble programmed death-1 and soluble programmed death ligand 1 protein expression and immune status in patients

with recurrent aphthous ulcer

Jiang Nan, Luo Liang, Liu Li, Sun Xiaoqin, Jiang Xing, Cai Yang. (Dept. of Periodontal and Oral Mucosal Diseases, The Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81460104). Correspondence: Cai Yang, E-mail: caiyang85 @163.com.

ObjectiveThis study aims to investigate the possible role and significance of soluble programmed death-1 (sPD-1) /soluble programmed death ligand 1 (sPD-L1) in the immune pathogeneses of recurrent aphthous ulcer (RAU). Methods A total of 30 RAU cases (18 cases of m inor RAU, 5 cases of major RAU, and 7 cases of herpetiform ulcers) were enrolled in this study. A total of 18 healthy people served as controls. Lymphocyte subsets (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, and CD16++56+) were investigated by flow cytometric analysis. Humoral immunity (IgG, IgA, IgM, C3, and C4) was explored by nephelometry immunoassay. The sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the sera of RAU patients were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay. The correlations of the sPD-1 and sPD-L1 protein levels with the immune status and clinical characteristics of the RAU patients were analyzed by SPSS 19.0.ResultsThe number of CD4+T cells decreased and the levels of IgM antibodies increased in the RAU patients relative to those in the normal controls (P<0.05). The sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the RAU patients were significantly higher than those in the control group (P<0.05). Meanwhile, the sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the patients with minor and major RAU were significantly higher than those in the control group (P<0.05). By contrast, no significant difference was found in the patients with herpetiform RAU (P>0.05). Positive correlations were noted between the sPD-1 protein level and the CD19+cell frequency or C4 level (r1=0.389, P1=0.034;

r2=0.382, P2=0.037).ConclusionCellular immune hypofunction and humoral immunity disorders were found in the RAU patients. The PD-1/PD-L1 signaling pathway, which m ight be influenced by the involvement of sPD-1 and sPD-L1 proteins to a certain extent, may play some roles in the immune pathogenesis of RAU.

recurrent aphthous ulcer; soluble programmed death-1; soluble programmed death ligand 1; immune

R 781.5

A

10.7518/hxkq.2017.03.011

2016-09-11；

2016-12-09

國家自然科學(xué)基金（81460104）

江南，碩士，E-mail：344248851@qq.com

蔡揚(yáng)，教授，博士，E-mail：caiyang85@163.com