Zeste基因增強子人類同源物2抑制劑GSK 343調節(jié)巨噬細胞分化的作用

王忠朝范麗苑譚丹周驄羅世君

1.西南醫(yī)科大學口頜面修復重建和再生實驗室；

2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔內科；3.修復科，瀘州 646000

Zeste基因增強子人類同源物2抑制劑GSK 343調節(jié)巨噬細胞分化的作用

王忠朝1,2范麗苑1,3譚丹1,2周驄1,2羅世君1,3

1.西南醫(yī)科大學口頜面修復重建和再生實驗室；

2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔內科；3.修復科，瀘州 646000

目的 研究Zeste基因增強子人類同源物2（EZH2）抑制劑GSK343調節(jié)巨噬細胞亞群的分化，探討EZH2在牙周炎中潛在的治療作用。方法 將巨噬細胞RAW 264.7分為4組：空白組（A組）、對照組（B組）、內毒素（LPS）刺激組（C組）、LPS+GSK343組（D組）。細胞經培養(yǎng)及相應處理后，利用免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測其表型生物學標志變化，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、白細胞介素-10（IL-10）和精氨酸酶-1（Arg-1）。利用大腸桿菌吞噬試驗檢測巨噬細胞RAW 264.7在不同條件下對大腸桿菌的吞噬作用。結果LPS可以誘導RAW 264.7產生M 1表型生物標志（TNF-α和iNOS表達增加），在加入EZH2抑制GSK 343后，IL-10和A rg-1表達升高，提示EZH2抑制劑GSK 343可以誘導RAW 264.7細胞由M 1型向M 2型轉化；RAW 264.7細胞具有吞噬大腸桿菌的作用，加入LPS的條件下吞噬大腸桿菌作用加強，而EZH2抑制劑GSK343可以調節(jié)RAW 264.7細胞對大腸桿菌的吞噬作用。結論 EZH2抑制劑GSK343可以調節(jié)巨噬細胞的分化，在牙周炎的治療中可能具有潛在作用。

巨噬細胞； 牙周炎； 表觀遺傳學； 微環(huán)境

TNF-α）和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等，主要功能是促炎和介導吞噬等；M 2型為選擇性活化型，其表面主要生物學標志物為白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和精氨酸酶-1（Arginase-1，Arg-1），其主要功能是調節(jié)免疫反應和促進組織修復。牙周炎是一個復雜的慢性感染性疾病，其特征為產生炎癥及造成牙齒支持組織的破壞。巨噬細胞參與的免疫反應在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用，是防止細菌侵入牙周組織的防線，與此同時，過度的免疫反應也可能會破壞牙周組織，最終導致附著喪失和牙槽骨的吸收[3]。因此，在牙周炎的治療中，如果巨噬細胞能轉化為M 2型，那么既能發(fā)揮抗炎及免疫調節(jié)的作用，又可以防止對牙周組織的破壞，達到最佳的治療效果。Zeste基因增強子人類同源物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）屬于多梳基因家族，是一種重要的組蛋白，具有甲基轉移酶作用，能夠抑制其下游靶基因的轉錄，調節(jié)干細胞的自我更新。本文通過研究EZH2抑制劑GSK 343誘導巨噬細胞亞群分化的作用，探討其在牙周炎中潛在的治療作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

大腸桿菌內毒素（lipopolysaccharide，LPS）及胎牛血清（Sigma公司，美國），TNF-α及IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（BioLegend公司，美國），β-actin、Arg-1和iNOS免疫印跡抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)[4]

RAW 264.7小鼠巨噬細胞購于西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，提前12 h以密度為每孔1×106個細胞接種于六孔板中。

1.3 細菌培養(yǎng)[5]

大腸桿菌（0111:B4）由西南醫(yī)科大學微生物實驗室提供，培養(yǎng)于pH=7的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中。取400 m L液體培養(yǎng)基，加瓊脂粉6 g，溶解，滅菌，滅菌溫度121 ℃，時間20 m in。將菌落接種到裝有5 m L種子培養(yǎng)基的具塞試管中，在37 ℃、200 r·m in-1的搖床上培養(yǎng)。

1.4 實驗方法

實驗分4組：A組，空白組，僅為大腸桿菌，不添加巨噬細胞；B組，對照組，大腸桿菌和巨噬細胞共培養(yǎng)；C組，LPS刺激組，大腸桿菌和巨噬細胞共培養(yǎng)基礎上加入100 ng·L-1LPS刺激細胞；D組，LPS+GSK343組，在C組基礎上添加3 μg·L-1EZH2抑制劑GSK343共培養(yǎng)。利用免疫印跡和ELISA檢測細胞表型生物學標志變化，包括TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1；利用大腸桿菌吞噬試驗檢測細胞在不同條件下對大腸桿菌的吞噬作用。

1.4.1 ELISA法檢測TNF-α和IL-10的表達 分別收集LPS刺激24 h的RAW 264.7細胞培養(yǎng)上清，檢測巨噬細胞TNF-α和IL-10的表達情況。按照TNF-α及IL-10 ELISA試劑盒說明操作，以1︰250稀釋包被抗體200 μL，4 ℃包被過夜，洗板3次，加入培養(yǎng)上清100 μL，室溫孵育1 h后洗板3次，加入以1︰250稀釋的生物素標記檢測抗體100 μL，室溫孵育1 h后洗板3次，加入以1︰300稀釋的親和素標記辣根過氧化物酶100 μL，室溫孵育30 m in后洗板7次，加入底物液100 μL，室溫避光孵育15 m in后加入2 mol·L-1的H2SO4終止反應，450 nm波長檢測光密度（optical density，OD）值。

1.4.2 免疫印跡法測定iNOS和Arg-1活性 1）iNOS活性測定。LPS刺激RAW 264.7細胞24 h后收集培養(yǎng)液上清，按檢測試劑盒的操作程序，取200 μL培養(yǎng)液上清，加入100 μL Griess Reagent R1，再加入等體積Griess Reagent R2，混勻，室溫靜置10 min，于540 nm處檢測各樣品OD值，以β-actin為基準。2）Arg-1活性測定。參照Lumeng等[6]的方法，加入100 μL 0.1%Triton X-100裂解液，LPS刺激細胞48 h后，加入150 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1MnCl2共100 μL，56 ℃溫育10 m in，加入100 μL 0.5 mol·L-1Arg-1，37 ℃溫育30 m in，加入800 μL H2SO4/H3PO4混合液終止反應。隨后加50 μL 9% α-異亞硝基苯丙酮，95 ℃溫育30 min，于540 nm處檢測各樣品OD值，以β-actin為基準。

1.4.3 熒光標記大腸桿菌吞噬試驗[7]加入大腸桿菌前，RAW 264.7細胞饑餓2 h，以100 ng·L-1LPS和3 μg·L-1GSK343刺激24 h。刺激完成后，使用100 μL PBS重懸大腸桿菌至終質量濃度20 g·L-1，低速超聲混勻20 s，共3次，然后加入100 μL IgG，37 ℃下渦旋振蕩孵育1 h，以4 ℃ PBS清洗20 m in，洗3次，移出上清液，同2 m L PBS及2 mg處理完成的大腸桿菌加入玻璃試管中，超聲振蕩5 m in，加入到刺激完畢的細胞中，每孔100 μL，作用1~2 h，PBS洗3 m in，共3次，再加入100 μL PBS讀數(shù)，照相，在吞噬熒光標記大腸桿菌后測量OD值進行熒光定量分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 LPS可以誘導RAW 264.7產生M 1型生物標志

如圖1所示，在LPS刺激下（C組），巨噬細胞產生的TNF-α較對照組和空白組升高，IL-10較對照組和空白組降低（P<0.05）；圖2顯示，在LPS刺激下（C組），巨噬細胞iNOS的表達水平較對照組和空白組升高，Arg-1的表達水平較對照組和空白組降低，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。該結果提示，在LPS刺激下，巨噬細胞具有異質性，在局部炎癥反應特異性微環(huán)境中可以活化成M 1型巨噬細胞，具有促炎功能，引起組織破壞。

圖 1 ELISA檢測TNF-α及IL-10的結果Fig 1 The results of ELISA on TNF-α and IL-10

圖 2 免疫印跡測定法結果Fig 2 The results of the Western blotting

2. 2 GSK343抑制LPS誘導的M 1型標志物并使RAW264.7 產生M 2型生物標志物

如圖1所示，在LPS刺激后，加入EZH 2抑制劑GSK343（D組），巨噬細胞產生的TNF-α較對照組和空白組明顯升高，較LPS刺激組明顯降低，IL-10較對照組和空白組明顯降低，較LPS刺激組明顯升高；圖2顯示，在LPS+GSK 343刺激下，巨噬細胞iNOS表達水平較對照組和空白組明顯升高，較LPS刺激組明顯降低，Arg-1的表達水平較對照組和空白組明顯降低，較LPS刺激組明顯升高（P<0.05），以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。由此可以推測，EZH2抑制劑GSK 343可以介導巨噬細胞由M 1型向M 2型轉化，從而發(fā)揮抗炎和組織修復的作用。

2.3 GSK343同時介導LPS導致的巨噬細胞RAW 264.7 吞噬功能的改變

在LPS刺激下，巨噬細胞活化成M 1型，而GSK343可以介導巨噬細胞由M 1型向M 2型轉化。如圖3所示，巨噬細胞活化成M 1型，吞噬功能增強，細胞核外吞噬的紅色的大腸桿菌顆粒增多，在加入EZH2抑制劑GSK343后，巨噬細胞的吞噬功能恢復到與對照組相似。經統(tǒng)計學分析，LPS刺激組吞噬功能增加（P<0.05），而LPS+GSK343組吞噬功能與對照組無明顯差異（P>0.05），提示巨噬細胞M 1型的促炎狀態(tài)被抑制，而恢復到M 2型的抗炎狀態(tài)。

圖 3 巨噬細胞的吞噬功能變化 熒光顯微鏡 × 200Fig 3 Changes in phagocytic function of macrophages fluorescence m icroscope × 200

3 討論

牙周炎可以造成牙周支持組織的破壞。牙菌斑生物膜是最主要的致病因素，菌斑的細菌及其產物是引發(fā)牙周炎必不可少的始動因子。LPS是革蘭陰性細菌獨有的一類具有高度活性的致病物質，對牙周組織有很高的毒性和抗原性，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。牙周炎的發(fā)生是細菌、毒素因子和機體之間防御功能的平衡被打破所致，是一種復雜的免疫炎癥反應。目前有研究[8]證實，一些編碼抗體反應以及炎癥介質的重要基因，包括IL-1、IL-6、TNF-α、維生素D受體等，其基因序列的變異可能會改變機體某些組織結構、抗體反應以及炎癥介質的調控，從而對牙周炎的易患性及其嚴重程度產生影響。除了基因多態(tài)性對牙周炎易患性的影響，個體在環(huán)境因素的作用下，一些與牙周炎相關基因的甲基化狀態(tài)也可能影響疾病的發(fā)生和發(fā)展，并且這種改變是可以遺傳的。牙周組織中特定的基因啟動子感應激素而引起表觀遺傳學方面的改變可能是牙周炎發(fā)病的重要原因。在牙周炎中，基因表達的改變是由于表觀遺傳的修飾。Gomez等[9]研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子基因表達改變導致的甲基化模式可能導致炎癥疾病。在牙周炎中發(fā)現(xiàn)，炎癥細胞因子如IL-1、IL-4、IL-6和IL-10存在過表達。Stenvinkel等[10]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性的炎癥導致DNA甲基化，使細胞因子信號傳導抑制劑沉默，誘導細胞因子信號的活躍表達。細胞因子如IL-6和干擾素 -γ（interferon-γ，IFN -γ）在慢性牙周炎患者的炎癥組織中過表達[11]。IFN-γ啟動子的低甲基化可能會增加IFN-γ在慢性牙周炎的轉錄，從而導致IFN-γ過表達[12-13]。相反，一些基因[8]，例如TNF-α和環(huán)氧合酶-2在CpG位點的甲基化則抑制其表達。Zhang等[14]報道，甲基化模式的改變可能是牙周炎中調節(jié)TNF-α轉錄的關鍵因素。

巨噬細胞是具有異質性的細胞，在不同環(huán)境中可以發(fā)生不同性質的活化，成為具有不同表型和功能特征的亞群。從活化途徑看，至少包括M 1和M 2兩種類型[15]。M 1型巨噬細胞，即經典活化的巨噬細胞（classically activated macrophage），其活化需雙信號，包括IFN-γ、外源性或內源性TNF-α的誘導劑如細菌LPS等；其基本表現(xiàn)是IL-12高表達和IL-10低表達，較特異的標志物有人白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR、CD40L、iNOS等；其功能是參與Th1型免疫應答，抗感染和抗腫瘤。M 1型巨噬細胞具有促炎的功能，不但能分泌大量促炎因子（主要包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23等）發(fā)揮促炎作用，而且能產生一氧化氮和活性氧（reactive oxygen species，ROS）來殺傷溶酶體內的細胞和病原體。但M 1型巨噬細胞的促炎功能亢進會加重組織破壞，甚至發(fā)展成為全身炎癥反應綜合征（system ic inflammatory response syndrome，SIRS）導致死亡。M 2型巨噬細胞，即替代性活化的巨噬細胞（alternatively activated macrophage），包括3種亞型，分別為M 2a、M 2b、M 2c，其活化不需要雙信號，由IL-4、IL-13等誘導分化；其基本表現(xiàn)為IL-10高表達和IL-12低表達，較特異的標志物有CD163、CD206等；其功能是參與Th2型免疫應答，抑制Th1型免疫應答和炎癥，誘導局部的免疫耐受狀態(tài)，促進組織重建以及修復，促進新生血管生成進而促進腫瘤細胞增殖和轉移。M 2a型細胞主要發(fā)揮促基質重建和組織修復功能，其生成的纖維連接蛋白1屬于細胞外基質結構元件，能連接糖蛋白和細胞基質，二者都有利于基質重建和組織修復。此外，M 2a型細胞合成的聚胺類物質，能影響細胞因子的生成并抑制鄰近淋巴細胞的增殖，進而發(fā)揮一定的免疫調節(jié)功能。M 2b和M 2c型細胞主要發(fā)揮免疫調節(jié)功能，兩者均表達大量的IL-10，而IL-10能通過抑制多種促炎因子的生成及其功能抑制炎癥反應，發(fā)揮免疫調節(jié)作用。

EZH2是一種甲基化酶[16-18]，屬于多梳基因家族，是一種重要的組蛋白，具有甲基轉移酶活性，能夠抑制其下游靶基因的轉錄，并調節(jié)干細胞的自我更新。在胚胎發(fā)育、腫瘤進展及干細胞維持中發(fā)揮重要作用。EZH2通過H3K 27側鏈上的ε氨基使組蛋白發(fā)生甲基化，參與基因的轉錄抑制，通過抑制染色體中的靶基因而調節(jié)細胞增殖，可能參與了腫瘤的增殖、侵襲與轉移等過程。

本研究利用免疫印跡及ELISA檢測RAW 264.7細胞表型生物學標志變化，大腸桿菌吞噬試驗檢測RAW 264.7細胞功能變化，結果顯示，GSK343可以誘導RAW 264.7細胞由M 1型向M 2型轉化，因此可以推論，EZH2抑制劑GSK343可抑制巨噬細胞甲基化，在牙周炎的治療中具有潛在作用，這為牙周炎的治療提供了一種可能的思路和方法。

遺傳信息，如DNA序列已不能完全解釋基因調控和疾病過程的機制。表觀遺傳學，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA，可以調節(jié)基因表達和影響疾病的進展[19]。目前口腔表觀遺傳學研究尚處于早期階段，認識遺傳因素和表觀遺傳因素的作用，對開發(fā)口腔疾病預防和治療有不可忽視的價值。

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（本文編輯 吳愛華）

Therapeutic effect of enhancer of Zeste homolog 2 inhibitor GSK343 on periodontitis by regulating macrophage diffe-rentiation

Wang Zhongchao1,2, Fan Liyuan1,3, Tan Dan1,2, Zhou Cong1,2, Luo Shijun1,3. (1. Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China; 2. Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, China; 3. Dept. of Prosthodontics, The Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, China)

ObjectiveTo explore the therapeutic effect of enhancer of Zeste homolog 2 (EZH2) inhibitor GSK343 on periodontitis by regulating m icrophage differentiation.MethodsMacrophage RAW 264.7 cells were divided into the blank (A group), control (B group), lipopolysaccharide (LPS) stimulation (C group), and LPS+GSK343 (D group) groups. Phenotype transformations was determ ined through Western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay by detecting the differentiation of phenotypic biological markers, including tumor necrosis factor-α (TNF-α), inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin-10 (IL-10), and Arginase-1 (Arg-1). Metergasis was identified by perform ing a phagocytosis test on Escherichia coli (E. coli).ResultsMacrophage RAW 264.7 cells produced classical phenotypic biomarkers (M 1) TNF-α and iNOS under LPS stimulation. The expression levels of IL-10 and Arg-1 increased after adding GSK343 into the culture medium. GSK 343 also induced the conversion of M 1 macrophages into M 2 macrophages. Macrophage RAW 264.7 cells exerted a phagocytic effect on E. coli, and this effect was enhanced after adding LPS into the culture medium. GSK343 regulated the macrophage RAW 264.7 phagocytosis of E. coli.ConclusionGSK343 possibly participates in the regulation of macrophage differentiation and, consequently, in the latent treatment of periodontitis.

macrophage; periodontitis; epigenetic; m icroenvironment巨噬細胞是免疫系統(tǒng)的重要成分之一，在機體的先天性免疫反應和獲得性免疫反應中起著關鍵作用，對機體內穩(wěn)態(tài)環(huán)境平衡具有重要意義。它能夠偵測入侵病原體和異質性抗原，啟動先天性免疫反應，且其抗原加工遞呈作用對獲得性免疫反應的啟動也十分重要，在維持促炎和抗炎的免疫平衡中可能起到控制開關的作用[1-2]。在炎癥狀態(tài)下，單核細胞到達病灶，并進一步分化為M 1和/或M 2型巨噬細胞，不同分化狀態(tài)下其細胞表面的主要生物學標志物不同，其中M 1型為經典活化型，其表面主要生物學標志物為腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2017.03.007

Supported by: Fund of Science and Technology Bureau of Luzhou [2016-S-66(1/3)]. Correspondence: Fan Liyuan, E-mail: 243683547@qq.com.

2016-11-05；

2017-01-02

瀘州市科技局基金[2016-S-66(1/3)]

王忠朝，主治醫(yī)師，碩士，E-mail：9333829@qq.com

范麗苑，講師，碩士，E-mail：243683547@qq.com